Regolazione chemiogenetica nelle cellule precursori derivate da cellule staminali riprogrammate nel trattamento delle malattie neurodegenerative

La nostra ricerca si concentra sull'illustrazione del meccanismo patogenetico alla base della malattia neurodegenerativa, integrando al contempo tecnologie avanzate per sviluppare tecniche di terapia cellulare efficaci per applicazioni cliniche. Il nostro recente lavoro ha trapiantato cellule staminali chemiogeneticamente modificate in modelli murini di malattia di Parkinson. Moduliamo le attività neuronali di una cellula con farmaci designer, quindi monitoraggio elettrofisiologico e valutazione comportamentale. Utilizziamo principalmente CRISPR per l'ingegneria genetica, l'elettrofisiologia per monitorare l'attività neurale e il test comportamentale per valutare il recupero della funzione nei modelli di malattia di Parkinson. L'efficienza delle cellule del trapianto aumenta con un'adeguata indicazione, sopravvivenza e contributo funzionale al tessuto ospite nella terapia basata sulle cellule staminali, nel trattamento della malattia neurodegenerativa. Attività cellulare incontrollata correlata a conseguenze negative, inclusa la genesi del tumore.

L'utilizzo della tecnologia nelle cellule staminali umane riprogrammate e nei neuroni driver fornisce i mezzi per controllare con precisione le attività neuronali attraverso la somministrazione del farmaco di progettazione CNO.

[Istruttore] Per iniziare, mescolare delicatamente da 50 a 100 nanogrammi del vettore linearizzato, frammento uno e frammento due, in un rapporto molare da uno a tre a tre molari, insieme a una miscela di clonazione 2X. Incubare la miscela a 55 gradi Celsius per un'ora per facilitare la ricombinazione omologa utilizzando l'assemblaggio Gibson. Inserire l'RNA guida che ha come bersaglio il sito AAVS1 nel sito BBS1 del vettore PX458. Mantenere le cellule staminali riprogrammate nei terreni di coltura, puntando a una densità cellulare compresa tra due e 5 milioni di cellule per millilitro. Ora, mescola da due a 5 milioni di cellule, due microgrammi di ciascun plasmide donatore e due microgrammi di plasmide GRNA in 100 microlitri di tampone elettroporico. Trasferire la miscela di cellule e plasmidi in una cuvetta per eseguire l'elettroporazione. Successivamente, trasferire le celle elettroporate in piastre a sei pozzetti rivestite con poli-D-lisina e laminina. Distribuire circa 500.000 cellule per pozzetto in due millilitri di terreno di coltura. Dopo 72 ore di elettroporazione, utilizzare un citometro a flusso per selezionare le cellule fluorescenti positive. Configurare lo smistatore con il canale FITC per il rilevamento ZsGreen. Includere le cellule staminali neurali indotte non trattate come controlli negativi per definire la fluorescenza di base. Piastra singole cellule ZsGreen-positive in piastre da 96 pozzetti pre-rivestite con poli-D-lisina e laminina e aggiungi 200 microlitri di terreno di coltura per pozzetto. Mantieni la coltura da sette a 14 giorni. Isolare singoli cloni che mostrano fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un set di filtri proteici fluorescenti verdi. Dopo aver espanso le cellule positive su piastre rivestite da 48 pozzetti, dividerle in due parti, una per la coltura continua e l'altra per la genotipizzazione. Estrarre il DNA genomico dai cloni candidati. Preparare la miscela PCR utilizzando due riparazioni primarie, una per confermare l'inserimento del gene di interesse e un'altra per distinguere tra cloni omozigoti ed eterozigoti. Digerire le cellule, lavarle in PBS e centrifugare a 250 g per tre minuti. Condurre iniezioni stereotassiche unilaterali di tre microlitri di 6-idrossidopamina a una concentrazione di cinque microgrammi per microlitro sull'animale anestetizzato. Individua il corpo striato destro utilizzando le coordinate corrette. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di apomorfina a un milligrammo per chilogrammo utilizzando una soluzione di 0,5 milligrammi per millilitro disciolta in soluzione salina quattro settimane dopo l'intervento chirurgico per convalidare le lesioni. Somministrare un'iniezione stereotassica di quattro microlitri della sospensione cellulare preparata nel modello murino della malattia di Parkinson. Eseguire il test del cilindro in più punti temporali dopo il trapianto di cellule. Posizionare un bicchiere di vetro con diametro di 20 centimetri e altezza di 30 centimetri su una superficie piana e non riflettente. Quindi, posizionare una telecamera dall'alto sopra il cilindro per catturare l'intero diametro. Posiziona ogni mouse al centro del cilindro e avvia la registrazione video simultanea per tre minuti per sessione. Dopo la sessione, rimetti il mouse nella sua gabbia di casa. Valutare il movimento degli arti superiori dei topi durante la sessione di tre minuti. Calcolare il numero di contatti con la parete effettuati dall'arto anteriore danneggiato rispetto al totale dei contatti effettuati da entrambi gli arti anteriori. Somministrare soluzione salina o clozapina N-ossido alla dose di 1,2 milligrammi per chilogrammo tramite iniezione intraperitoneale. Eseguire nuovamente il test del cilindro per valutare la modulazione comportamentale nel modello murino di malattia di Parkinson dopo la somministrazione di clozapina N-ossido. Dopo aver estratto il cervello dall'animale anestetizzato e averlo immediatamente immerso nel liquido cerebrospinale artificiale ghiacciato a base di saccarosio per preservare l'integrità cellulare Utilizzando un vibratomo, tagliare il cervello in sezioni di 300-400 micrometri di spessore. Regolare le impostazioni di ingresso del gas per equilibrare con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica a 34 gradi Celsius. Trasferisci le fette di cervello in una camera riempita con liquido cerebrospinale artificiale. Caricare le pipette di vetro con una soluzione intracellulare ghiacciata, assicurandosi che la resistenza dell'elettrodo sia compresa tra sette e 10 megaohm. Monta le fette in una camera di registrazione sommersa superfusa a due millilitri al minuto con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato a 34 gradi Celsius. Posizionamento di pipette mediante micromanipolatori motorizzati al microscopio a contrasto interferenzo-interferenza differenziale a infrarossi. Stabilisci la configurazione dell'intera cellula utilizzando un'aspirazione delicata per applicare patch ai neuroni con resistenza superiore a un gigaohm. Bloccare le celle a meno 70 millivolt utilizzando un amplificatore patch clamp e acquisire correnti post-sinaptiche eccitatorie spontanee di base per otto minuti a una frequenza di campionamento di 10 kilohertz. Aggiungere 50 micromolari di clozapina N-ossido nella camera di registrazione subito dopo la misurazione di base. Continuare a registrare i dati per 16 minuti e monitorare i cambiamenti nella frequenza o nell'ampiezza della corrente postsinaptica eccitatoria spontanea. Infine, eseguire una procedura di washout sostituendo la soluzione di clozapina N-ossido con liquido cerebrospinale artificiale fresco e continuare a registrare per valutare il recupero dell'attività sinaptica. La modulazione emogenetica con clozapina N-ossido ha ridotto il movimento controlaterale degli arti anteriori nei topi trapiantati con hM4Di e lo ha aumentato nei topi trapiantati con hM3Dq rispetto al trattamento con soluzione salina, dimostrando un controllo comportamentale bidirezionale. Le registrazioni elettrofisiologiche hanno rivelato che le cellule trapiantate con hM4Di avevano intervalli più lunghi e ampiezze di picco più piccole nelle correnti post-sinaptiche eccitatorie spontanee, mentre le cellule trapiantate con hM3Dq avevano intervalli più brevi e ampiezze maggiori, indicando la rispettiva soppressione e potenziamento dell'attività sinaptica. L'analisi in immunofluorescenza ha confermato l'espressione in vivo di tirosina idrossilasi e ZsGreen nelle cellule hM4Di e hM3Dq trapiantate, supportando il successo dell'integrazione del trapianto.