Name: Regolazione chemiogenetica nelle cellule precursori derivate da cellule staminali riprogrammate nel trattamento delle malattie neurodegenerative (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri la regolazione chemiogenetica delle cellule staminali riprogrammate per la terapia del Parkinson. Questo metodo utilizza modelli murini per valutare l'integrazione neuronale e il recupero funzionale mediante monitoraggio elettrofisiologico e test comportamentali.

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<ol><li>Thiel, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThiel%2C+G+%22Designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs%22">Designer receptors exclusively activated by designer drugs</a>. , Humana Press. (2015).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dreadds+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dreadds for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+revealed%3A+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li>
<li>Chehelgerdi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+promising+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+cancer+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploring the promising potential of induced pluripotent stem cells in cancer research and therapy.</a> Mol Cancer. 22 (1), 189(2023).</li>
<li>Song, J., Patel, R. V., Sharif, M., Ashokan, A., Michaelides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+as+a+neuromodulatory+approach+to+treating+neuropsychiatric+diseases+and+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics as a neuromodulatory approach to treating neuropsychiatric diseases and disorders.</a> Mol Ther. 30 (3), 990-1005 (2022).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nat Rev Neurosci. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Dell'anno, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+induced+dopaminergic+neurons+in+Parkinsonian+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Remote control of induced dopaminergic neurons in Parkinsonian rats.</a> J Clin Invest. 124 (7), 3215-3229 (2014).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+of+grafted+human+PSC-derived+neurons+in+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Chemical control of grafted human PSC-derived neurons in a mouse model of Parkinson's disease.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 817-826 (2016).</li>
<li>Bjorklund, A., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+cell+therapy%3A+From+cell+replacement+to+circuitry+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine cell therapy: From cell replacement to circuitry repair.</a> J Parkinsons Dis. 11 (S2), S159-S165 (2021).</li>
<li>Alcacer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+stimulation+of+striatal+projection+neurons+modulates+responses+to+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic stimulation of striatal projection neurons modulates responses to Parkinson's disease therapy.</a> J Clin Invest. 127 (2), 720-734 (2017).</li>
<li>Alexander, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+in+transgenic+mice+expressing+evolved+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors.</a> Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).</li>
<li>Stachniak, T. J., Ghosh, A., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+synaptic+silencing+of+neural+circuits+localizes+a+hypothalamus+midbrain+pathway+for+feeding+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic synaptic silencing of neural circuits localizes a hypothalamus midbrain pathway for feeding behavior.</a> Neuron. 82 (4), 797-808 (2014).</li>
<li>Kang, H. J., Minamimoto, T., Wess, J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+for+cell-type-specific+modulation+of+signalling+and+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics for cell-type-specific modulation of signalling and neuronal activity.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 93(2023).</li>
<li>Miyanishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+tests+predicting+striatal+dopamine+level+in+a+rat+hemi-Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Behavioral tests predicting striatal dopamine level in a rat hemi-Parkinson's disease model.</a> Neurochem Int. 122, 38-46 (2019).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IPSC-derived+midbrain+organoids+functionally+integrate+into+striatum+circuits+and+restore+motor+function+in+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Human IPSC-derived midbrain organoids functionally integrate into striatum circuits and restore motor function in a mouse model of Parkinson's disease.</a> Theranostics. 13 (8), 2673-2692 (2023).</li>
<li>Xiong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+neurons+repair+circuits+and+restore+neural+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived neurons repair circuits and restore neural function.</a> Cell Stem Cell. 28 (1), 112-126.e6 (2021).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+precursors+differentiated+from+human+blood-derived+induced+neural+stem+cells+improve+symptoms+of+a+mouse+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model.</a> Theranostics. 8 (17), 4679(2018).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+spinal+cord+slices+for+whole-cell+patch-clamp+recording+in+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons.</a> J Vis Exp. (143), (2019).</li>
<li>Wang, X., Han, D., Zheng, T., Ma, J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+induced+neural+stem+cell-derived+dopaminergic+neurons+by+DREADD+reveals+therapeutic+effects+on+a+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Modulation of human induced neural stem cell-derived dopaminergic neurons by DREADD reveals therapeutic effects on a mouse model of Parkinson's disease.</a> Stem Cell Res Ther. 15 (1), 297(2024).</li>
<li>Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+characterization+of+a+unilateral+6-OHDA-lesion+model+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice.</a> Behav Brain Res. 162 (1), 1-10 (2005).</li>
<li>Surmeier, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dopamine+in+modulating+the+structure+and+function+of+striatal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The role of dopamine in modulating the structure and function of striatal circuits.</a> Prog Brain Res. 183, 148-167 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2 x Rapid Taq Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>P222-01</td><td>utilizzato per l'analisi di genotipizzazione</td></tr><tr><td>2&volte; Mix di clonazione senza soluzione di continuità</td><td>Biomed Gene Tech.</td><td>CL117-01</td><td>utilizzato per la costruzione di plasmidi</td></tr><tr><td>6-OHDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4381</td><td>utilizzato per stabilire il modello di topi PD</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-EGFP</td><td>Addgene</td><td>80945</td><td>utilizzato come controllo</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry</td><td>Addgene</td><td>80947</td><td>plasmide originale per la costruzione di hM4Di-T2A-ZsGreen</td></tr><tr><td>AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry</td><td>Addgene</td><td>80948</td><td>plasmide originale per la costruzione di hM3Dq-T2A-ZsGreen</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Plasmide donatore costruito basato su #80947</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Plasmide da donatore costruito basato su #80948</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>Utilizzato per la digestione delle cellule</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Apomorphine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4393</td><td></td></tr><tr><td>Liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>125 mM di NaCl, 2,5 mM di KCl, 2 mM di CaCl2, 1,25 mM di NaH2PO4, 1 mM di MgSO4, 25 mM di glucosio e... 26 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Ascorbic</td><td>Integratore Sigma-Aldrich</td><td>1043003</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Yeasen</td><td>53003ES10</td><td></td></tr><tr><td>Clozapina-N-ossido</td><td>Enzo</td><td>BML-NS105</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>Desipramina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Fattore inibitorio della leucemia umana (hrLIF)</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td></td></tr><tr><td>Liquido intracellulare ghiacciato</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>130 mM K-gluconato, 16 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0,4 mM Na3-GTP, 0,3% di neurobiotina</td></tr><tr><td>KnockOut Siero sostitutivo</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Roche</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Integratore</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacido non essenziale acidi (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 11 suite</td><td>di software Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Software di acquisizione e analisi dei dati per elettrofisiologia patch-clamp</td></tr><tr><td>Mezzo di differenziazione di fase 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% integratore di B-27, 1% integratore di N-2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 &; M SAG1 e 100 ng/mL FGF8&nbsp;</td></tr><tr><td>Mezzo di differenziazione di fase 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% integratore di B-27, 1% integratore di N-2, 1% NEAA e 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-&beta; III, 10 & micro; M DAPT, 0,2 mM di acido ascorbico e 0,5 mM di cAMP.</td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-D-lisina (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Primer per la genotipizzazione</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Inserimento Avanti: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Inversione di inserimento: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; Omozigosi Anteriore:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Omozigosi inversa: GATCCTCTCTGGCTCCATCG</td></tr><tr><td>pX458</td><td>Addgene</td><td>152199</td><td></td></tr><tr><td>SAG1</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-426-M01</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Yeasen</td><td>53004ES50</td><td></td></tr><tr><td>liquido cerebrospinale artificiale a base di saccarosio (s-ACSF)</td><td></td><td></td><td>234 mM saccarosio, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglucosio, 0,5 mM CaCl2 e 10 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Coltura di cellule staminali media</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>&nbsp; 48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) e 48% Neurobasal, con l'aggiunta di 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 &micro; M SB431542, e 3 &micro; M CHIR99021</td></tr><tr><td>TGF-&beta; III</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per trapianto</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Tampone HBSS con 5 g/L di D-glucosio, 100 ng/mL di BDNF, 100 ng/mL di GDNF e 0,2 mM di acido ascorbico</td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica&nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Patch-clamp a celle intere</td><td>Molecular Devices</td><td>&nbsp; MultiClamp700B</td><td></td></tr></tbody></table>

regolazione chemiogenetica nelle cellule precursori derivate da cellule staminali riprogrammate nel trattamento delle malattie neurodegenerative

Chemogenetic Regulation in Reprogrammed Stem Cell-derived Precursor Cells in Treating Neurodegenerative Diseases

La Figura 1 mostra le fasi chiave di questo approccio metodologico per cellule staminali umane riprogrammate ingegnerizzate che esprimono recettori DREADD eccitatori (hM3Dq) o inibitori (hM4Di) per valutare l'integrazione funzionale e la modulazione di precursori dopaminergici derivati in un modello murino di malattia di Parkinson (PD). La Figura 2 delinea la strategia di knock-in genico mediata da CRISPR/Cas9 per l'introduzione di costrutti non di fusione di hM...

Regolazione chemiogenetica nelle cellule precursori derivate da cellule staminali riprogrammate nel trattamento delle malattie neurodegenerative

The integration of designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADD) with stem cell-based therapies presents an advanced strategy for ...

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