Assemblaggio di bioreattori per la coltura continua di comunità fecali complesse

Studiamo le interazioni tra i batteri ospiti e il modo in cui i fattori intrinseci ed estrinseci influenzano la salute, concentrandoci sugli effetti batterici sullo sviluppo, la progressione e la risposta al trattamento del cancro. Abbiamo studiato gli inibitori del checkpoint immunitario anti-PD-1 nelle comunità batteriche, scoprendo che i metaboliti batterici migliorano l'efficacia della terapia anti-PD-1.

Isolare l'impatto dei fattori dell'ospite sul microbioma in vivo è difficile a causa di molteplici influenze. L'array di microbioreattori consente l'esame controllato di processi specifici, chiarendo i loro effetti diretti sulle comunità microbiche. Questo protocollo offre un metodo economico per coltivare comunità fecali in condizioni controllate, consentendo ai ricercatori di eseguire esperimenti in parallelo in tempi relativamente brevi.

[Istruttore] Per iniziare, procurati un array di reattori a sei pozzetti stampato in 3D. Taglia dodici strisce da 25 millimetri da un tubo in PTFE da 1/8 di pollice e usa un rasoio per radere le punte. Inserire un'estremità di ciascuna striscia nell'apertura della filettatura di un Luer maschio con un raccordo da 25 a 28 filettature. Avvitare saldamente i raccordi nelle aperture designate per lo scarico e il campione dell'array. Ora, inserisci una barra di microagitazione in ogni pozzetto del reattore. Avvitare un raccordo filettato maschio 1/4-28 nei fori sorgente di ciascun pozzetto del reattore. Avvitare i raccordi adattatori femmina della barra del tubo Luer nei raccordi filettati per i collegamenti di scarico e di sorgente di ciascun pozzetto del reattore. Quindi avvitare la femmina Luer X ai raccordi adattatori per portagomma da 3-32/2 pollici nei raccordi filettati da 1/4-28 per le porte del campione. Posizionare un setto di gomma sopra gli adattatori della punta del tubo e ripiegare la parte superiore. Quindi, tagliare due set di tubi E-LFL da 2,06 millimetri per le linee di scarico e di origine. Utilizzare acqua calda per ammorbidire il tubo per un fissaggio più semplice. Collegare il tubo al Luer X femmina ai raccordi adattatori per portagomma da 1/8 di pollice per i collegamenti di origine e scarico. Ora fissa un Luer maschio con un anello di bloccaggio X a un adattatore per portagomma da 1/8 di pollice che si adatta all'altra estremità del tubo. Avvitare un Luer X femmina all'adattatore per portagomma da 1/16 di pollice che si adatta ad esso. Collegare il tubo a due fermi di dimensioni appropriate ai collegamenti di origine e scarico corrispondenti. Quindi fissare un altro Luer X femmina al raccordo dell'adattatore per portagomma da 1/16 di pollice all'altra estremità del tubo. Dopo aver ripetuto l'operazione per tutti i raccordi di origine e di scarico, inserire un Luer maschio con anello di bloccaggio Raccordi adattatori per portagomma da X a 1/8 di pollice su un pezzo di tubo E-LFL 2. Collegare un'estremità all'adattatore per portagomma femmina Luer X non occupato da 1/16 di pollice all'estremità di ciascuna sezione di tubo a due stop per tutti i pezzi. Dopo aver ripetuto l'operazione per tutti i raccordi di sorgente e di scarico, collegare il tubo E-LFL da 2,06 millimetri per le linee di sorgente dei pozzi del reattore uno e due, utilizzando le estremità opposte di un Luer T femmina. Quindi fissare un pezzo di tubo di cinque centimetri con Luer maschio con anello di bloccaggio X a raccordi adattatori da 1/8 di pollice su ciascuna estremità all'uscita centrale della T, portando a una seconda giunzione a T. Ora collega il tubo sorgente E-LFL da 2,06 millimetri per il terzo reattore al lato opposto del secondo T. Collega un altro segmento di tubo da cinque centimetri con un Luer maschio con anello di bloccaggio da X a un adattatore da 1/8 di pollice su un'estremità e un Luer femmina con anello di bloccaggio da X a 1/8 di pollice sull'altra. Quindi, collegare un Luer maschio con anello di bloccaggio X a un raccordo adattatore per portagomma da 1/8 di pollice a un'estremità di un pezzo di tubo E-LFL da 2,06 millimetri da 25 centimetri. Fissare un Luer X femmina a un raccordo adattatore per portagomma da 1/8 di pollice all'altra estremità e coprirlo con un foglio di alluminio. Per assemblare la bottiglia per la raccolta dei rifiuti, fissare senza stringere un tappo a due fori su una bottiglia da due litri. Inserire i raccordi filettati maschio 1/4-28 in entrambi i fori del cappuccio. Quindi collegare un Luer femmina con adattatore per portagomma da 1/8 di pollice al raccordo filettato maschio che non si collega al tubo in PTFE precollegato nel cappuccio. Collegare un pezzo di tubo E-LFL da 2,06 millimetri di cinque centimetri all'adattatore della punta del tubo sulla bottiglia. Collegare un Luer maschio con anello di bloccaggio X all'adattatore per portagomma da 1/8 di pollice all'altra estremità del tubo prima di coprirlo con un foglio. Infine, coprire l'intero tappo della bottiglia con un foglio di alluminio prima di sterilizzare in autoclave a 121 gradi Celsius e 15 psi per 45 minuti. Una volta completata l'autoclave, serrare i raccordi e le guarnizioni in alluminio e posizionare i reattori in una camera anaerobica per 48 ore prima dell'uso. Allineare l'array del reattore all'interno della camera anaerobica su una piastra di agitazione magnetica impostata a 1.600 giri/min. Quindi inserire il tubo a due fermi sia per la linea di alimentazione che per quella di scarico nelle fascette delle pompe peristaltiche corrispondenti. Bloccare i morsetti in posizione se questa operazione viene eseguita meno di 25 ore prima dell'uso. In caso contrario, lasciarlo allentato per ridurre l'usura del tubo. Ora rimuovi il tappo di alluminio dalla bottiglia di origine. Avvitare i raccordi nei raccordi maschio Luer con filettatura 1/4-28, assicurandosi che queste aperture siano collegate al tubo interno in PTFE. Rimuovere i tappi di alluminio e collegare un filtro per siringa da 0,22 micrometri alla linea di sfiato di cinque centimetri sia del flacone di origine che del flacone di scarto. Iniziare il flusso a una velocità moderata per iniziare a riempire il reattore. Assicurarsi che il tubo di cintura all'interno di ciascun pozzetto del reattore sia posizionato più in basso rispetto al tubo di origine per evitare un riempimento eccessivo o lo svuotamento completo di ciascun pozzetto. Quando i reattori iniziano a riempirsi, controllare che tutti i pozzetti raggiungano lo stesso volume e che il fluido fluisca nella cintola prima di lasciare i reattori a degassare durante la notte. Iniziare trasferendo i materiali sperimentali nella camera anaerobica per 24 ore. Dopo aver calcolato la quantità di inoculo fecale necessaria, trasferire i campioni fecali conservati in fiale criogeniche nella camera anaerobica e lasciarli scongelare per 15 minuti. Con una punta della pipetta a foro largo, trasferire il materiale fecale dalle fiale criogeniche a una provetta conica da 50 millilitri. Centrifugare la provetta sigillata a 200 g per cinque minuti per depositare il particolato. Trasferire nuovamente le provette nella camera anaerobica. Quindi rimuovere il surnatante. Utilizzare una spatola da laboratorio per autoclave per trasferire i 5,7 grammi di solidi fecali in una nuova provetta conica da 50 millilitri. Aggiungere 17,1 millilitri di soluzione salina sterile anaerobica alla provetta e sigillare ermeticamente. Ora agitare la provetta per cinque minuti prima di centrifugare come dimostrato in precedenza. Utilizzare una salvietta da laboratorio con candeggina al 10% per sterilizzare i setti sopra ogni reattore per almeno due minuti. Dopo aver rimesso i campioni nella camera anaerobica, pipettare il surnatante in nuove provette coniche da 50 millilitri. Ora trasferisci 3,8 millilitri di surnatante di liquame fecale in sei siringhe separate da cinque millilitri dotate di aghi da 16 pollici di calibro 1,5. Rimuovere la salvietta candeggina dai setti del reattore. Quindi inserire l'ago attraverso il setto e iniettare lentamente 3,8 millilitri di liquame fecale in ciascun reattore prima di lasciare i reattori riposare per una notte. Dopo un'incubazione di 16-18 ore, avviare il flusso verso il reattore. Impostare la piastra di agitazione magnetica alla massima velocità subito dopo aver iniettato il liquame fecale. La composizione della comunità microbica in entrambi i reattori replicati è cambiata nel tempo con specie diverse che mostravano un'abbondanza relativa variabile nei giorni. I batteri anaerobi più esigenti, come i generi Clostridium, sono stati costantemente rilevati in ogni reattore in ogni momento.