Name: Imaging del trasferimento di energia della risonanza di Förster su cellule vive delle dinamiche di attivazione di Akt metabolicamente regolate nelle cellule HepG2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Scopri l'imaging FRET per analizzare le dinamiche di attivazione di Akt nelle cellule HepG2 in tempo reale. Questo metodo offre approfondimenti sulla regolazione metabolica e le vie di segnalazione insulinica nel cancro.

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<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>Gatto#25200-056</td><td>Utilizzare il PBS ghiacciato per il lavaggio cellulare</td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare con fondo in vetro da 15 mm</td><td>NIDO</td><td>Gatto#801001</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; mL di fiale criogeniche Nalgene</td><td>Termo Scientifico</td><td>Gatto#5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>5 ml di pipette sierologiche Stripette</td><td>Corning</td><td>Gatto#4487</td><td></td></tr><tr><td>95% Etanolo</td><td>Kermel</td><td>Gatto#C028005</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale A1 HD25/A1R HD25</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td>Ingrandimento: 40&volte;, Apertura numerica (NA): 1,30, Tempo di permanenza dei pixel: 2,4 ms, Dimensione dei pixel: 1024</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gatto#A9393</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>VWR Scienze della vita</td><td>Gatto#N208-10g</td><td></td></tr><tr><td>Corning 25&nbsp; cm2 fiasche di coltura rettangolari</td><td>Corning</td><td>Gatto#430639</td><td></td></tr><tr><td>Contacelle automatizzato Countess 3</td><td>Termo Scientifico</td><td>http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini della camera di conteggio delle cellule Countess</td><td>Termo Scientifico</td><td>http://www.thermofisher.com/#C10228</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatori a vortice digitali</td><td>Termo Scientifico</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gatto#D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Provette Safe-Lock 1,5&nbsp; Ml</td><td>Eppendorf</td><td>Gatto#022363204</td><td></td></tr><tr><td>Kit per la rilevazione di micoplasmi EZ-PCR</td><td>Industrie Biologiche</td><td>Gatto# 20-700-20</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, Australia</td><td>Gibco</td><td>Gatto#10099141</td><td></td></tr><tr><td>Integratore GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>Gatto#35050061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 9</td><td>GraphPad Software</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>Collezione Nazionale di Colture Cellulari Autenticate</td><td>#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510&nbsp; http://www.cellbank.org.cn/</td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione Tipo 37</td><td>Laboratori Cargille</td><td>Gatto #16237</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gatto#I5500-50MG</td><td>Caldo a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>LB Brodo (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>Gatto#10855001</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo minimo essenziale (MEM)</td><td>Gibco</td><td>Gatto#11095080</td><td>Caldo a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>mySPIN 12&nbsp; mini centrifuga</td><td>Termo Scientifico</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Uno</td><td>Termo Scientifico</td><td>https://www.thermofisher.com</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Plan Fluor 40&times;/1.30 Lente ad olio</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements-AR</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali (NEAA) (100x)</td><td>Gibco</td><td>Gatto#11140050</td><td></td></tr><tr><td>Piastre AAR LB a colpo singolo&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Gatto#A55802</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 chimicamente competente E.&nbsp; Coli</td><td>Invitrogen</td><td>Gatto#C737303</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>Gatto#B8R05606</td><td></td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Gibco</td><td>Gatto#10010023</td><td></td></tr><tr><td>pEevee-iAkt-NES (7.033&nbsp; bp)</td><td>Miura et&nbsp; al31</td><td>https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>Gatto#15070063</td><td></td></tr><tr><td>Profilassi con plasmocin</td><td>InvivoGen</td><td>Gatto#formica-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gatto#P4832</td><td></td></tr><tr><td>Bagni di precisione per uso generale</td><td>Termo Scientifico</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Kit miniprep per la centrifuga QIAprep</td><td>QIAGEN</td><td>Gatto#27106</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>SnapGene di Dotmatics</td><td>https://www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>Gatto#11360070</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtro siringa, 0,22&nbsp; &mu; m</td><td>Millipore</td><td>Gatto#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit stage top incubatore</td><td>COLPO DI TOKAI</td><td>https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata UltraPure priva di DNasi/RNasi</td><td>Invitrogen</td><td>Gatto#10977015</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione Xfect</td><td>Takara Bio</td><td>Gatto#631317</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging del trasferimento di energia della risonanza di förster su cellule vive delle dinamiche di attivazione di akt metabolicamente regolate nelle cellule hepg2

Live-Cell F&#246;rster Resonance Energy Transfer Imaging of Metabolically Regulated Akt Activation Dynamics in HepG2 Cells

Per studiare l'attivazione di Akt nelle cellule HepG2, le cellule sono state seminate su piastre di imaging pre-rivestite e trasfettate con il biosensore pEevee-iAkt-NES basato su FRET (Figura 2A), progettato per consentire il monitoraggio in tempo reale della fosforilazione di Akt. Dopo la trasfezione, le cellule sono state sottoposte a fame sierica per 4 ore in un terreno privo di siero per sincronizzare il loro stato metabolico e ridurre al minimo la segnalazione dell'insulina basale....

Imaging del trasferimento di energia della risonanza di Förster su cellule vive delle dinamiche di attivazione di Akt metabolicamente regolate nelle cellule HepG2

Metabolically regulated Akt activation is a critical node in the insulin signaling cascade and provides valuable insights into the relationship between ...

L'eterogeneità cellulare è un ostacolo alla descrizione accurata delle complessità delle dinamiche cellulari, che sono essenzialmente mediate. Ecco perché siamo qui per l'imaging di singole cellule. I recenti sviluppi nei biosensori FRET geneticamente codificati hanno migliorato la specificità e rivoluzionato il tracciamento in tempo reale di Akt all'interno delle cellule, che è fondamentale per comprendere l'eterogenetica e sviluppare terapie farmacologiche personalizzate.Il cancro e il diabete sono attraverso complesse vie metaboliche. Per decodificare la biocomplessità della via di segnalazione dell'insulina nel cancro, utilizziamo l'imaging FRET su cellule vive all'avanguardia con risoluzione di singola cellula. Abbiamo scoperto che l'ottimizzazione del microscopio confocale, la configurazione hardware e software, insieme alla messa a punto della potenza del laser e alla regolazione del guadagno del rivelatore, sono fondamentali per ridurre al minimo il rumore e la diafonia spettrale nei segnali FRET.I metodi di massa tradizionali, come il western blotting, mancano di dettagli temporali spaziali e mascherano l'eterogeneità cellulare. Il nostro protocollo colma questa lacuna utilizzando l'imaging FRET su cellule vive per catturare la risposta cellulare con elevata precisione e accuratezza. Per iniziare, aggiungi un millilitro di una soluzione di poli-L-lisina da 0,1 milligrammi per millilitro a un piatto di imaging e fai oscillare il piatto per coprire l'intera superficie.Dopo l'incubazione notturna, aspirare la soluzione di poli-L-lisina in eccesso dalla capsula. Sciacquare delicatamente la superficie con PBS 3 volte, riposando per cinque minuti ciascuna per rimuovere completamente la Poli-L-Lisina non legata. Aspirare il PBS e asciugare all'aria la capsula di imaging rivestita a 37 gradi Celsius per almeno tre ore.Quindi, seminare le cellule HepG2 nella piastra di imaging pre-rivestita da 24 a 48 ore prima della trasfezione per assicurarsi che raggiungano il 70-90% di confluenza. Scongelare e agitare il reagente di trasfezione insieme al plasmide che codifica per il biosensore di trasferimento di energia di risonanza Forster. Eseguire un breve giro per raccogliere tutta la miscela sul fondo del tubo.Mescolare otto microgrammi di plasmide con il tampone di reazione fino a un volume finale di 100 microlitri utilizzando un vortice per cinque secondi ad alta velocità. Eseguire una breve centrifuga per raccogliere la miscela sul fondo del tubo. Aggiungere 2,4 microlitri del polimero di trasfezione alla provetta contenente il DNA plasmatico diluito e mescolare bene.Incubare il biosensore e la miscela di polimeri a 37 gradi Celsius per 15 minuti per consentire la formazione di complessi di nanoparticelle. Centrifugare il tubo per cinque secondi a 5.000 g per raccogliere il contenuto sul fondo. Aggiungere tutti i 100 microlitri di soluzione di complesso di nanoparticelle goccia a goccia al terreno di coltura cellulare e far oscillare delicatamente la piastra avanti e indietro per mescolare.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per quattro ore o tutta la notte. Dopo aver rimosso i complessi di nanoparticelle dalle cellule, sostituire la soluzione con due millilitri di terreno di coltura completo fresco. Rimettere la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius fino al momento dell'analisi.Analizzare le cellule al microscopio a fluorescenza. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra ai fosfori e sciacquare la piastra due volte con 1X PBS, lasciando che ogni risciacquo duri cinque minuti. Aggiungere due millilitri di terreno di cottura a ciascun piatto attorno al bordo del piatto.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro ore. Quindi, accendere il computer, quindi accendere l'unità principale del microscopio confocale e gli accessori in sequenza. Successivamente, attiva il sistema laser ruotando la chiave in posizione di accensione e ruotando gli interruttori a levetta del lancio laser.Quindi, ruotare gli interruttori di blocco laser in senso orario in posizione di accensione per entrambe le linee laser. Infine, accendere il controller di sistema. Avvia il software NIS-Elements AR dal desktop.Fare clic su A1 per l'acquisizione per avviare la configurazione dell'imaging e selezionare le configurazioni ottiche appropriate in base ai requisiti sperimentali. Installare l'incubatore superiore del tavolino del microscopio e fissarlo con le viti. Riempire il bagnomaria interno con acqua sterile a doppia distillazione.Quindi, installare il riscaldatore superiore e accendere l'alimentazione per il stage riscaldatore, riscaldatore per vasca e riscaldatore per lenti. Pulire la lente ad immersione in olio 40X con carta per lenti inumidita con etanolo al 95% e posizionare una piccola goccia di olio da immersione sulla lente dell'obiettivo. Quindi, posizionare la capsula di imaging contenente le cellule HepG2 sul tavolino del microscopio e fissarla con il supporto.Chiudere la camera e incubare le cellule per una o due ore per consentire l'equilibrio. Avviare la finestra di acquisizione ND dal menu File di NIS-Elements AR. Selezionare la scheda Tempo per impostare l'intervallo, la durata e i loop per l'imaging time-lapse. Fare clic sulla scheda XY e premere il pulsante Aggiungi per includere le cellule HepG2 per l'imaging a fuoco.Quindi, seleziona la casella Z per impostare la posizione Z. Fare clic su Sfoglia per selezionare una cartella di destinazione. Inserisci il nome dell'esperimento nella casella Nome file.Fare clic su Esegui ora per avviare l'acquisizione e avviare il processo di imaging time-lapse. Registra le misurazioni di base per un massimo di 30 minuti senza terreni integrati con insulina. Metti in pausa l'imaging a intervalli regolari.Rimuovere delicatamente il terreno dal piatto con fondo di vetro e aggiungere un millilitro di terreno integrato con la concentrazione di insulina appropriata. Riprendi l'acquisizione dell'immagine e fai clic su Fine alla fine dell'esperimento per chiudere. Infine, esegui il backup e archivia in modo sicuro le immagini acquisite per l'analisi.Un aumento dose-dipendente della fosforilazione di Akt è stato osservato dopo la stimolazione dell'insulina, con un forte aumento che si è verificato a 300 insulina picomolare. Oltre questa concentrazione, i livelli di fosforilazione si sono stabilizzati e non sono diminuiti nemmeno dopo che l'insulina è diminuita. Il rapporto FRET normalizzato ha mostrato una tendenza simile, con un segnale crescente dopo la stimolazione dell'insulina e il mancato ritorno al basale dopo la sospensione dell'insulina.Dopo la stimolazione sequenziale dell'insulina, è stato osservato un aumento progressivo del rapporto FRET normalizzato, supportando la risposta di attivazione di Akt dose-dipendente.

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FRET basato giornalisti sono sempre più utilizzati per monitorare le attività di chinasi e fosfatasi in cellule vive. Qui si descrive un metodo su come utilizzare FRET-based reporter per valutare ciclo-dipendente delle cellule cambiamenti nella fosforilazione di destinazione.

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine ​​multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

MRP4 regola varie ciclici eventi di segnalazione nucleotidi-dipendenti, tra cui un ruolo di recente chiarito nella migrazione cellulare. Descriviamo un approccio diretto, ma multiforme per svelare i bersagli molecolari a valle di MRP4 con conseguente identificazione di un interattoma MRP4 unico che gioca un ruolo chiave nella regolazione messa a punto della migrazione dei fibroblasti.

Metodi per studiare Mrp4 contenenti complessi macromolecolari nel regolamento di Fibroblasto migrazione

Qui vi presentiamo un protocollo per celle di immagine che esprimono fluorescenti tipo angiotensina recettori 1a proteina-tag verde durante endocitosi avviate dal trattamento angiotensina II. Questa tecnica comprende lisosomi etichettatura con un secondo marcatore fluorescente, e quindi utilizzando software per analizzare la co-localizzazione di recettori e lisosomi in tre dimensioni nel tempo.

Imaging cellulare dal vivo e analisi 3D del recettore dell&#39;angiotensina di tipo 1a tratta degli transfettati embrionali umane cellule renali Utilizzando Microscopia confocale

Il laser a femtosecondi strettamente focalizzato può fornire una stimolazione precisa alle cellule aggiungendosi a una microscopia confocale che consenta l'osservazione e la fotostimolazione in tempo reale. La fotostimolazione può attivare eventi molecolari cellulari, tra cui percorso di segnalazione ERK e lampi mitocondriali di specie reattive dell'ossigeno.

La fotostimolazione da parte del laser Femtosecondo attiva la segnalazione o eventi mitocondriali regolati dal segnale extracellulare (ERK) nelle cellule bersaglio

Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) passano da uno stato quiescente a uno stato di differenziazione a causa della loro plasticità metabolica durante la formazione del sangue. Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi degli HSPC.

Analisi del metabolismo delle cellule staminali ematopoietiche

I protocolli di analisi basati su cellule di trasferimento di energia di risonanza di Förster risolti nel tempo sono descritti per la quantificazione semplice, specifica, sensibile e robusta del trasduttore di segnale fosforilato endogeno e dell'attivatore della trascrizione (STAT) 1/3/4/5/6 proteine in lisati cellulari in un formato a 384 pozzetti.

Saggi di trasferimento di energia di Förster Resonance risolti nel tempo per la misurazione di proteine STAT fosforilate endogene in cellule umane

Il saggio del flusso metabolico cellulare in tempo reale misura il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare, che corrisponde alla produzione di adenosina trifosfato mitocondriale e glicolitica, utilizzando sensori di pH e ossigeno. Il manoscritto spiega un metodo per comprendere lo stato energetico degli osteoblasti e la caratterizzazione e l'interpretazione dello stato bioenergetico cellulare.

Utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

Questo protocollo descrive l'imaging a fluorescenza e l'analisi dei coenzimi metabolici endogeni, della nicotinamide adenina ridotta (fosfato), del dinucleotide (NAD(P)H) e dell'adenina dinucleotide della flavina ossidata (FAD). L'imaging a autofluorescenza di NAD(P)H e FAD fornisce un metodo non distruttivo privo di etichette per valutare il metabolismo cellulare.

Imaging ad autofluorescenza per valutare il metabolismo cellulare

Presentiamo un protocollo per visualizzare direttamente le attività metaboliche nelle cellule regolate da aminoacidi utilizzando la microscopia a diffusione Raman stimolata (DO-SRS) con ossido di deuterio (acqua pesante D2O), che è integrata con la microscopia a fluorescenza di eccitazione a due fotoni (2PEF).

Imaging chimico bioortogonale del metabolismo cellulare regolato da amminoacidi aromatici

Questo protocollo integra un sistema di bioreattore personalizzato con spettroscopia NMR iperpolarizzata ¹³C per misurare il metabolismo del piruvato in tempo reale nelle cellule vive, migliorando la riproducibilità e l'accuratezza cinetica per studi metabolici e applicazioni di screening farmacologico.

Rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR iperpolarizzata a 13C

Scopri l'imaging FRET per analizzare le dinamiche di attivazione di Akt nelle cellule HepG2 in tempo reale. Questo metodo offre approfondimenti sulla regolazione metabolica e le vie di segnalazione insulinica nel cancro.

Imaging del trasferimento di energia della risonanza di Förster su cellule vive delle dinamiche di attivazione di Akt metabolicamente regolate nelle cellule HepG2 (Video) | JoVE Journal

Imaging del trasferimento di energia della risonanza di Förster su cellule vive delle dinamiche di attivazione di Akt metabolicamente regolate nelle cellule HepG2

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