Generazione e caratterizzazione di astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane prive di ribonucleoproteina messaggero X fragile

Questo lavoro si concentra su quattro astrociti umani specifici del cervello e su come vengono alterati da disturbi dello sviluppo neurologico come la sindrome dell'X fragile. Il lavoro precedente ha utilizzato modelli animali per studiare principalmente i neuroni, quindi questo lavoro aggiunge una nuova dimensione a quest'area di ricerca.

Le intuizioni meccanicistiche degli studi sugli animali hanno avuto un successo clinico limitato. La sfida principale è quella di ottenere informazioni simili sui neuroni e sugli astrociti di origine umana.

Il nostro protocollo ha generato con successo astrociti funzionali specifici per il vento, che mostrano un metabolismo disregolato, glicolitico e mitocondriale nella sindrome dell'X fragile, consentendo indagini sul ruolo delle cellule gliali nella biologia della malattia. Nonostante le crescenti prove sul ruolo chiave della glia nella funzione neuronale nella salute e nella malattia, si sa poco su come gli astrociti umani siano influenzati nei disturbi dello sviluppo neurologico, come la sindrome dell'X fragile.

Guardando al futuro, ci baseremo su questo quadro per studiare come gli astrociti e le loro interazioni con i neuroni sono alterati dalla malattia, e quindi come questi possono essere corretti da interventi terapeutici.

[Istruttore] Per iniziare, rivestire un piatto a sei onde con Matrigel diluito in un rapporto di uno a 60 in DMMF 12 avanzato. Conservare il piatto rivestito a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius. Il giorno della coltura, rimuovere il materiale di rivestimento dalla piastra e aggiungere un millilitro di terreno otto essenziale completo, insieme a un inibitore di roccia a una concentrazione finale di una X. Posizionare la capsula all'interno di un'incubatrice. Impostare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica prima di aggiungere le cellule staminali pluripotenti indotte umane, o IPSC. Seminare le IPSC umane in un mezzo essenziale completo con l'inibitore della roccia a una concentrazione finale di una X per migliorare l'aderenza della colonia. Il giorno successivo, sostituire l'intero terreno essenziale otto con un terreno fresco, privo dell'inibitore della roccia. Continuare a reintegrare il terreno ogni giorno fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, il che richiede circa quattro o cinque giorni. Quando le colonie raggiungono l'80% di confluenza, aggiungere una miscela di collagenasi e dispase per staccarle enzimaticamente dal piatto. Una volta che le colonie iniziano a sollevarsi, rimuovere la capsula dall'incubatrice e aggiungere due millilitri di DPBS per neutralizzare l'attività enzimatica. Utilizzando DPBS, raschiare le colonie e raccogliere la sospensione in una provetta conica da 15 millilitri, utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri. Quindi, con una pipetta sierologica da 10 millilitri, triturare delicatamente la sospensione due o tre volte per rompere le colonie. Lasciate che le colonie si stabiliscano. Dopo circa due minuti, aspirare la miscela enzimatica DPBS lasciando circa un millilitro di liquido nella provetta. Quindi aggiungere due millilitri di DPBS al tubo e mescolare picchiettando delicatamente per risospendere le colonie. Lasciali depositare e ripeti questo processo due volte per rimuovere l'enzima residuo. Dopo aver rimosso il surnatante, sospendete nuovamente le colonie in un millilitro di terreno essenziale otto completo e impiattatele in un piatto rivestito di Matrigel appena preparato. Sollevare enzimaticamente le cellule staminali pluripotenti indotte umane come descritto in precedenza. Impiattarli su un piatto di coltura in sospensione non aderente da 100 millimetri con terreno chimicamente definito. Posizionare la sospensione cellulare su un agitatore orbitale a 40 giri al minuto per sette giorni in condizioni normossiche per facilitare lo sviluppo delle sfere cortico. L'ottavo giorno, trasferire le sfere di cortico in un mezzo di proliferazione cellulare e mantenerle per sette giorni. Per indurre la specificazione gliale, incubare le sfere corticali in terreno di arricchimento gliale per due settimane per ottenere sfere gliali precoci. Per la maturazione delle sfere gliali precoci, sostituire il fattore di crescita dei fibroblasti di base H con 20 nanogrammi per millilitro di fattore inibitorio della leucemia e mantenere le sfere per quattro settimane.

Dopo quattro settimane nel terreno di maturazione, continuare a mantenere le sfere nel terreno di arricchimento gliale per periodi prolungati. Per prevenire l'aggregazione e la perdita di vitalità, tritare meccanicamente le sfere gliali ogni due settimane, utilizzando una lama industriale sterile. Sostituire l'intero terreno con DNase one per rimuovere i frammenti di DNA generati dal taglio. Successivamente dissociare le sfere gliali in monostrati di cellule progenitrici degli astrociti, utilizzando un kit di dissociazione della papaina. Placcare le cellule dissociate su una coltura cellulare, una piastra aderente trattata pre-rivestita con Matrigel a una diluizione da uno a 80. Propagare le cellule progenitrici degli astrociti in terreno di arricchimento gliale fino a raggiungere l'80% di confluenza. Le cellule rimuovono il terreno esausto e lo raccolgono in un tubo conico. Aggiungere il terreno di distacco cellulare enzimatico alle cellule e attendere uno o due minuti. Una volta che le cellule iniziano a staccarsi, aggiungere il terreno esaurito per neutralizzare l'attività enzimatica. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 800 G per due minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in un terreno di arricchimento gliale. Piastra circa una volta per 10 alla potenza di sei cellule per pozzetto su una piastra rivestita di Matrigel con una diluizione da uno a 80. Per la crioconservazione, risospendere il pellet cellulare in una miscela fredda di 90% di terreno di proliferazione della sfera di cortico e 10% di crioprotettore. Trasferire le cellule ri-sospese in fiale criogeniche. Spostare immediatamente le fiale criogeniche in una scatola criogenica e conservarle in congelatore a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, trasferire tutte le fiale criogeniche in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Caratterizzare le cellule progenitrici degli astrociti dissociate mediante immunocolorazione con Vimenton e marcatori IAM del fattore nucleare. Per confermare la specificità regionale dei quattro nuclei cerebrali delle APC umane derivate da IPSC, eseguire l'analisi QPCR in tempo reale per la scatola della testa della forcella umana G1 e la scatola dell'omeologo umana, B4. Differenziare le APC in astrociti e mezzo di differenziazione astrocitaria per 14 giorni. Piastra gli astrociti su un piatto di vetro da 35 millimetri con una densità di cinque volte 10 alla potenza di tre cellule per piatto per misurare la loro risposta all'adenosina cinque tri fosfato. Lasciare che le celle aderiscano al fondo di vetro per 24 ore. Lavare le cellule aderenti tre volte con la soluzione salina bilanciata di Hank senza calcio. Quindi incubare le cellule nel terreno di coltura contenente cinque diureide metrico con rapporto micromolare 2:00 AM e F127 pluronico allo 0,02% per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le cellule due volte con il terreno di coltura, sostituire il terreno con due millimolari di calcio contenenti la soluzione di sale bilanciato di Hank. Immagini delle cellule a due fotogrammi al secondo, utilizzando un obiettivo a immersione in olio 60X su un microscopio invertito a compensazione della deriva focalizzata. Infine, registrare le risposte di calcio indotte da ATP dopo l'aggiunta di ATP a una concentrazione finale di cinque millimolari al segno dei 25 secondi. Le colonie umane di IPSC hanno espresso marcatori pluripotenti opt four e nano come confermato dall'immunocolorazione. Le APC derivate dalla sindrome dell'X fragile e le linee di controllo hanno mostrato proporzioni comparabili di cellule positive alla vimentina e alla NFIA. Le cellule progenitrici degli astrociti provenienti sia dal controllo che dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo con sindrome dell'X fragile hanno mostrato una sovraregolazione di Fox G1, rispetto a HOXB4, indicando un'identità del proencefalo. Gli astrociti derivati dalle linee della sindrome dell'X fragile IPSC hanno mostrato un numero ridotto di espressione di GFAP. Gli astrociti di controllo e della sindrome dell'X fragile mostravano transitori di calcio indotti da ATP, ma il numero di responder era significativamente più basso negli astrociti della sindrome dell'X fragile. L'ampiezza di picco del primo transiente di calcio evocato da ATP era significativamente più bassa negli astrociti della sindrome dell'X fragile rispetto alle cellule di controllo. Gli astrociti della sindrome dell'X fragile derivati da IPSC hanno mostrato un aumento della glicolisi, della capacità glicolitica e delle riserve glicolitiche, ma hanno mostrato una significativa diminuzione della respirazione massimale rispetto agli astrociti di controllo.