Name: Editing dellepigenoma CRISPR nelle cellule umane mediante trasfezione del DNA plasmidico e consegna della nucleofecazione dellmRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Scopri l'editing dell'epigenoma CRISPR nelle cellule umane mediante trasfezione del DNA plasmidico e nucleofecazione dell'mRNA. Questo metodo consente la modulazione genica mirata senza rotture tossiche del DNA.

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Sebbene il contenuto genomico di ogni cellula del nostro corpo sia quasi identico, il profilo trascrizionale di ciascun tipo di cellula differisce notevolmente. Le modificazioni epigenetiche del DNA e delle proteine istoniche sono regolatori chiave dell'espressione trascrizionale. L'eucromatina trascrizionalmente attiva è caratterizzata da segni epigenetici distinti rispetto all'eterocromatina compatta e trascrizionalmente inattiva. Ad esempio, le regioni eterocromatiche sono definite da modificazioni repressive degli istoni, tra cui la trimetilazione sulla lisina 9 dell'istone 3 (H3K9me3), la trimetilazione sulla lisina 27 dell'istone H3 (H3K27me3) e la metilazione del DNA sulle citosine accanto alle guanine (CpG) ai promotori del gene1. Le regioni genomiche di espressione genica attiva sono definite tipicamente dall'acetilazione e dalla trimetilazione degli istoni sulla lisina 4 dell'istone 3 (H3K4me3)1.
La rivoluzione CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ha generato una vasta gamma di strumenti che consentono l'alterazione programmata delle sequenze genomiche. La tecnologia CRISPR si basa su un meccanismo di difesa procariotico in grado di scindere gli acidi nucleici in sequenze bersaglio programmabili. Le nucleasi CRISPR 2,3,4, gli editor di base 5,6 e gli editor principali 7,8 possono modificare la sequenza del DNA dei genomi dei mammiferi attraverso il taglio del DNA e la riparazione di queste rotture. Sebbene efficaci, queste strategie possono causare rotture del DNA in siti fuori bersaglio 9,10 e mutazioni strutturali genomiche su larga scala 11,12,13,14,15. Strumenti alternativi basati su CRISPR consentono una modulazione trattabile dell'attivazione e della repressione genica senza modificare la sequenza di DNA sottostante. Questi strumenti sfruttano un Cas9 carente di nucleasi (dCas9), consentendo il legame del DNA nei siti bersaglio dettati dalla sequenza di sgRNA, in combinazione con proteine effettrici che alterano il panorama della cromatina 16,17,18. Le proteine effettrici, come gli scrittori epigenetici, i lettori e le gomme, possono essere fuse direttamente con dCas9 o reclutate da un'impalcatura peptidica fusa con dCas9, come SunTag, o da un'impalcatura di RNA sull'sgRNA, come il sistema MS2-MCP 16,17,18. Esempi di strumenti programmabili per il controllo della trascrizione includono l'attivazione CRISPR (CRISPRa)19,20,21 e l'interferenza CRISPR (CRISPRi)22,23. CRISPRa funziona reclutando direttamente il meccanismo di trascrizione, aumentando l'espressione genica trascrizionale target19. Al contrario, CRISPRi reprime la trascrizione stabilendo H3K9me3, un segno epigenetico repressivo22.
I progressi nell'editing dell'epigenoma hanno consentito un ampio uso di questi strumenti in tutti i campi scientifici. Le fusioni di diversi domini effettori e proteine hanno ampliato il kit di strumenti degli editor di epigenomi disponibili 18,24,25,26,27,28,29,30. Inoltre, gli editor di epigenomi vengono utilizzati per decifrare i ruoli delle modificazioni epigenetiche 31,32,33,34,35,36, degli effettori 37,38,39 e delle mutazioni effettrici 28,40,41 nella regolazione genica. In particolare, CRISPRi e CRISPRa sono utilizzati negli screening di genomica funzionale per una varietà di processi biologici, tra cui la sopravvivenza cellulare42 e il destino cellulare 43,44,45,46,47. Inoltre, l'editing dell'epigenoma ha un potenziale terapeutico per l'ingegneria cellulare ex vivo e le terapie in vivo 18.
Qui, descriviamo i metodi per l'applicazione di due editor di epigenoma basati su dCas9 per la repressione trascrizionale programmabile in linee cellulari umane: CRISPRi22 e CRISPRoff48. CRISPRi è una fusione di dCas9 nel dominio repressivo KRAB da una proteina a dita di zinco come ZNF10 (KOX1) e ZIM322,23. Quando CRISPRi è mirato a uno specifico promotore genico, il dominio KRAB recluta uno scrittore H3K9me3, SETDB1, per reprimere il gene bersaglio (Figura 1A). Quando CRISPRi è espresso transitoriamente, l'H3K9me3 stabilito nel locus bersaglio non viene mantenuto e l'espressione genica viene ripristinata nel tempo 32,48. Per condurre knockdown stabili utilizzando CRISPRi, come nelle applicazioni di genomica funzionale, l'espressione costitutiva di CRISPRi nelle cellule insieme all'sgRNA è essenziale. Recentemente, CRISPRoff è stato progettato per programmare l'editing ereditario dell'epigenoma48. CRISPRoff è una fusione di una singola proteina di dCas9 con il dominio KRAB e il complesso de novo DNA metiltransferasi, DNMT3A e DNMT3L. Un impulso transitorio di CRISPRoff nelle cellule umane programma la deposizione di H3K9me3 e la metilazione del DNA nei geni bersaglio, che porta alla repressione a lungo termine dei geni bersaglio mediante il mantenimento della metilazione del DNA e di H3K9me3 (Figura 1B)48. Inoltre, le modifiche all'epigenoma possono essere annullate. Ad esempio, un gene che è stabilmente silenziato da CRISPRoff può essere riattivato da TET1-dCas9 che può rimuovere enzimaticamente i segni di metilazione del DNA nei loci bersaglio49.
Questo protocollo descriverà in dettaglio due metodi di somministrazione per l'espressione transitoria degli editor di epigenomi: la trasfezione del DNA plasmidico e la nucleofecazione dell'mRNA. Inoltre, descriviamo come utilizzare la citometria a flusso per valutare l'efficacia dell'editing dell'epigenoma in due geni endogeni, CLTA e CD55. Questi metodi possono essere adattati e applicati ad altri esperimenti di editing dell'epigenoma utilizzando editor aggiuntivi o possono essere utilizzati per indirizzare geni diversi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68089/68089fig01.jpg"> 
Figura 1: Schema del meccanismo e del flusso di lavoro di editing dell'epigenoma CRISPRi e CRISPRoff. (A) Schemi lineari del transgene sgRNA e dell'editor di epigenoma CRISPRi. L'aggiunta di CRISPRi e sgRNA consente l'aggiunta del marcatore istonico repressivo H3K9me3 per silenziare il locus bersaglio. Il livello più alto di silenziamento viene raggiunto precocemente dopo l'aggiunta di CRISPRi e il gene bersaglio viene generalmente riattivato dopo pochi passaggi. (B) Schemi lineari del transgene sgRNA e dell'editor di epigenoma CRISPRoff. L'aggiunta di CRISPRoff alle cellule che hanno come bersaglio un gene di interesse porta all'aggiunta di H3K9me3 repressivo insieme alla metilazione del DNA nei siti CpG per silenziare il gene bersaglio. Il silenziamento mediante CRISPRoff è ereditabile: l'alto livello di silenziamento viene raggiunto precocemente durante la trasfezione e persiste su più divisioni cellulari. (C) Panoramica della cronologia per l'editing dell'epigenoma tramite il metodo della trasfezione. Il giorno 0, le cellule vengono piastrate per la trasfezione. Il giorno 1, il plasmide editor e guida può essere introdotto nelle cellule tramite trasfezione. Il giorno 3, le cellule saranno valutate per l'espressione di BFP tramite citometria a flusso. La percentuale di BFP viene utilizzata come fattore normalizzante per determinare l'efficacia finale del silenziamento dell'esperimento per ciascuna condizione. Dal giorno 6 in poi, le cellule vengono analizzate per silenziare il reporter di interesse, poiché il livello più alto di silenziamento sarà raggiunto in questo giorno. (D) Panoramica del metodo di trasfezione in cui l'editor di epigenoma e i plasmidi sgRNA vengono aggiunti alle cellule in modo graduale. (E) Panoramica della cronologia per l'editing dell'epigenoma attraverso i metodi della nucleofezione. In questo protocollo, l'mRNA è la nucleofezione nelle cellule il giorno 0. Le cellule vengono valutate per il silenziamento il giorno 3 dopo la nucleofecazione utilizzando l'analisi della citometria a flusso. (F) Panoramica del protocollo di nucleofezione. Quantità appropriate di cellule e mRNA vengono mescolate e aggiunte in cuvette di nucleolettori. Se l'sgRNA viene introdotto per nucleofezione, può anche essere aggiunto a questa miscela. Le cuvette vengono inserite nel nucleocongelatore e vengono utilizzati codici di impulsi appropriati per introdurre l'mRNA nelle cellule. Dopo la nucleofezione, le cellule vengono piastrate e fatte passare per l'analisi nei giorni successivi. (G) Confronto tra la trasfezione plasmidica e le strategie di nucleofezione dell'mRNA per l'editing dell'epigenoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68089/68089fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Piastra con fondo a U a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>APC Anticorpo CD55</td> umano <td>BioLegend</td><td>311312</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSimphony A1 Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Waxie</td><td></td><td></td>11003428432</tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Countess Contatore di cellule automatizzato</td><td>Thermo Scientific</td><td>Countess 3</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRoff trasfezione plasmide</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>167981</tr><tr><td>Diluente 2 Reagente ematologico per citometria a flusso (fluido della guaina)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-029-361</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Alto glucosio</td><td>Thermo Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf provette</td><td>Thomas scientific</td><td>1159M35</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville&nbsp; Linea cellulare SF 4D-Nucleofector X Kit L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0281111</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE&trade; Kit di trascrizione T7 ULTRA</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>provette per strisce PCR</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>plasmide di espressione pLG1 sgRNA</td><td>Addgene</td><td></td><td></td>217306</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22-400-105</td><td></td></tr><tr><td>SF Linea cellulare a 96 pozzetti Nucleofector&reg; &nbsp; Kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture tissutali</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUVDL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione TransIT-LTI</td><td>Mirus</td><td>MIR 2306</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr></tbody></table>

editing dell'epigenoma crispr nelle cellule umane mediante trasfezione del dna plasmidico e consegna della nucleofecazione dell'mrna

CRISPR Epigenome Editing in Human Cells using Plasmid DNA Transfection and mRNA Nucleofection Delivery

Per tutti gli esperimenti di editing dell'epigenoma, controlli adeguati sono fondamentali per valutare l'efficienza dell'editing dell'epigenoma. Si consiglia di utilizzare un sgRNA di controllo, che non prende di mira alcuna sequenza nel genoma umano. L'utilizzo di un controllo guida non mirato darà la certezza che i cambiamenti nei loci target siano guidati dall'editor dell'epigenoma che viene indirizzato a quel sito piuttosto che solo dalla sovraespressione dell'editor dell'epigenoma o dal legame non specifico. Inoltre...

Editing dell'epigenoma CRISPR nelle cellule umane mediante trasfezione del DNA plasmidico e consegna della nucleofecazione dell'mRNA

Epigenetics refers to chemical modifications of histone proteins and DNA that can regulate the expression of genes. The human epigenome is altered ...

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