Monitoraggio della dinamica conformazionale di singole proteine non modificate mediante Nanotweezers plasmonici

Questa ricerca mira a ottenere informazioni sulle proteine label-free a livello di singola molecola in tempo reale, con particolare attenzione alle proteine che sono difficili da studiare utilizzando le tecniche attuali o che hanno rilevanza per la malattia. Le nanotweezer plasmoniche hanno recentemente dimostrato la loro capacità di monitorare le dinamiche conformazionali dopo il legame con piccole molecole, controllare la cinetica di disassemblaggio e chiarire i paesaggi di energia libera a livello di singola molecola. Attualmente, nessuna tecnica di caratterizzazione proteica consolidata è in grado di studiare la dinamica conformazionale di una singola molecola di proteine label-free.

Si ritiene che le nanotweezer plasmoniche abbiano il potenziale per riempire questa nicchia all'interno del campo. Questo vantaggio unico ci aiuta a studiare la relazione tra il cambiamento conformazionale delle proteine e le loro funzioni biologiche e le implicazioni nello sviluppo della malattia. La ricerca futura si concentrerà sulle proteine intrinsecamente disordinate e sulle proteine di membrana, poiché molte di queste sono implicate in diverse malattie come l'Alzheimer, il Parkinson e vari tipi di cancro.

Per iniziare, posiziona il campione rivestito di PEG-tiolo nella cella di flusso stampata in 3D utilizzando una pinzetta diritta, assicurandoti che lo strato d'oro sia rivolto verso l'alto. Staccare un lato del coperchio del nastro biadesivo in plastica PET trasparente. Posizionare con cautela il nastro sul campione e sulla cella di flusso, assicurandosi che le nanostrutture e i fori di aspirazione/uscita nella cella di flusso rimangano scoperti.

Utilizzando una pinzetta arrotondata, premere delicatamente attorno ai bordi del nastro per assicurarne l'adesione alla cella di flusso e al campione. Staccare l'altro lato del nastro e posizionare delicatamente un vetrino di copertura sul campione. Usa una pinzetta arrotondata per premere attorno ai bordi del vetrino coprioggetti per assicurarne l'adesione.

Questo processo crea un canale del liquido all'interno della cella di flusso con un'altezza di 50 micrometri e un volume di 3,5 microlitri. Utilizzando una piccola punta per pipetta, mescolare parti uguali della soluzione A e della soluzione B del silicone da duplicazione su un vetrino da microscopio con un rapporto di uno a uno o come specificato dal produttore. Riempire gli spazi tra il vetrino coprioggetto e la cella di flusso con un silicone per duplicazione misto, spingendolo delicatamente sotto il vetrino coprioggetti.

Tenere la cella di flusso capovolta e applicare con cura il silicone per duplicazione attorno alla parete interna del foro. Spostare delicatamente il silicone sui bordi visibili della parte inferiore della silice fusa del campione, lasciando asciugare il campione con lo strato d'oro rivolto verso l'alto fino a quando il silicone di duplicazione non si è completamente solidificato. Dopo aver verificato che tutti i componenti siano collegati correttamente, caricare l'interfaccia utente del sistema microfluidico sul computer.

Fare clic sull'icona di riproduzione accanto al distributore MUX e al filo, che controllano rispettivamente la valvola rotante 12 per uno e la valvola a tre vie per due per aprire le interfacce corrispondenti. Per bypassare la valvola a tre vie a due vie, aprire la porta uno del filo. Per montare la cella di flusso in pinzette plasmoniche, collegare i tubi di ingresso e di uscita alle parti appropriate della cella di flusso.

Posizionare la cella a flusso su un tessuto pulito con lo strato d'oro rivolto verso l'alto. Infrangere il tampone nella cella di flusso a una velocità di flusso elevata di circa 0,3 millilitri al minuto. Verificare che il fluido si muova attraverso il campione all'interno della cella di flusso e che non sia visibile alcun fluido all'esterno o al lato inferiore.

Applicare una o due gocce di olio da immersione sull'obiettivo 100X. Posizionare la cella di flusso nello stadio di nanotweezers plasmonici con lo strato d'oro rivolto verso il basso. Fissare la cella di flusso utilizzando clip metalliche sui magneti e bloccare il tavolino per mantenerlo in posizione.

Accendi la sorgente di luce bianca. Apri il software della fotocamera e regola il tempo di esposizione e il guadagno fino a quando le nanostrutture diventano visibili. Accendere il laser a una potenza relativamente alta e regolare manualmente l'asse Z fino a quando il punto laser non è visibile.

Accendere il controller piezoelettrico e selezionare le impostazioni appropriate per la porta di comunicazione e il volume massimotage. Impostare i valori degli assi X, Y e Z a metà della tensione massima per consentire un migliore allineamento del tavolino in tutte le direzioni. Allineare lo spot laser con una delle strutture a doppio nanoforo o DNH utilizzando le manopole di controllo degli assi X, Y e Z dello stadio principale.

Assicurarsi che il fotodiodo a valanga o l'APD siano accesi. Chiudere delicatamente l'involucro alle pinzette plasmoniche. Apri il software associato alla registrazione APD, come ad esempio un'interfaccia utente LabVIEW fatta in casa. Modificare il nome del file e impostare la frequenza di taglio su un kilohertz.

Quindi specificare il percorso del file desiderato in cui verranno salvati i file. Spegnere la sorgente di luce bianca e riaccendere il laser. Dopo aver impostato la potenza del laser su un livello appropriato, utilizzare i controlli piezoelettrici per regolare gli assi X, Y e Z fino a quando il segnale APD non è il più alto possibile.

Evitando la saturazione dell'APD e con una deviazione standard minima della traccia. Quindi, spegni il laser per preservare la durata delle nanostrutture. Far funzionare l'unità di controllo della pompa a siringa e l'interfaccia utente del distributore per impostare la valvola e prelevare la quantità desiderata di proteine.

Utilizzando l'interfaccia utente microfluidica, infondere la soluzione proteica a una velocità di flusso simile alla velocità di prelievo. Continuare l'infusione a questa velocità fino a quando la soluzione proteica non raggiunge la cella a flusso. Quindi impostare la portata su un valore appropriato per l'intrappolamento e attendere che la traccia si stabilizzi.

Verificare che il volume e il tempo sulla pompa a siringa corrispondano ai valori previsti. Per registrare i dati del segnale APD, regolare gli assi X, Y e Z secondo necessità utilizzando l'interfaccia utente del controller piezoelettrico. Dopo aver osservato un grande cambiamento nella trasmissione e nella deviazione standard, annotare il momento in cui ciò si verifica per il futuro ordinamento dei dati. Se la proteina deve essere rilasciata come parte dell'esperimento, spegnere il laser per circa cinque secondi, quindi riaccenderlo.

La traccia dovrebbe avere una grande variazione nella trasmissione e una deviazione standard significativamente più bassa, indicando un ritorno allo stato di base. Dopo aver completato l'esperimento, spegni il laser. Rimuovere la cella di flusso dallo stadio a tre assi e scollegare il tubo del sistema microfluidico.

Posizionare la cella a flusso su un tessuto pulito con lo strato d'oro rivolto verso l'alto. Usando un bisturi, taglia con cura la colla sotto il vetrino di copertura prima di sollevarlo delicatamente e smaltirlo. Tenere la cella di flusso inclinata con lo strato d'oro ancora rivolto verso l'alto e utilizzare una pinzetta arrotondata per rimuovere con cura la colla dalla parte inferiore della cella di flusso per liberare il campione.

Utilizzando una pinzetta diritta, prelevare il campione e sciacquarlo accuratamente con isopropanolo. Asciugare il campione utilizzando una pistola ad aria compressa. Un esperimento rappresentativo condotto sul carico di ferro in situ su una molecola di apoferritina dimostra l'uso di nanotweezers plasmonici come strumento per studiare le dinamiche conformazionali delle proteine.

La traccia di trasmissione dell'apoferritina rimane stabile quando intrappolata in una soluzione di PBS, indicando che non ci sono cambiamenti conformazionali significativi. Dopo l'esposizione alla soluzione ferrosa, le fluttuazioni delle deviazioni standard della traccia sono aumentate, indicando cambiamenti strutturali dinamici associati al carico di ferro. Dopo 20 minuti di esposizione al ferro, la traccia di trasmissione si è stabilizzata, indicando la transizione dell'apoferritina alla sua oloforma.

I grafici della funzione di densità di probabilità hanno dimostrato uno spostamento nella distribuzione della tensione al carico di ferro, supportando ulteriormente la transizione conformazionale dall'apoferritina all'oloferritina.