Isolamento e coltura di cellule primarie di Müller retiniche da ratti Sprague-Dawley (SD)

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule primarie di Müller retiniche da ratti neonatali di Sprague-Dawley (SD). La procedura comprende l'enucleazione dei bulbi oculari, la dissezione del tessuto retinico, l'estrazione e l'identificazione delle cellule e le considerazioni chiave per la successiva coltura cellulare.

Questo protocollo descrive l'isolamento e la coltura di cellule primarie di Muller retiniche da ratti SD Sprague-Dawley, che possono aiutare la ricerca retinica nella comunità scientifica. Il protocollo copre la dissezione retinica, l'estrazione e l'identificazione dell'IC e le considerazioni chiave sul controllo. Questo protocollo stabilisce un metodo efficiente, standardizzato e costoso per l'estrazione e il recupero di RMC dai rack SD legali. Il modello RMC può essere utilizzato per simulare condizioni patologiche come il diabete, la normalità e per assistere gli effetti dei farmaci.

[Narratore] Per iniziare, versare la soluzione di D-Hank in due piastre di coltura in vetro da 10 centimetri. Dopo l'eutanasia e la disinfezione del ratto SD neonatale, posizionarlo su un piatto curvo sterile. Usando una pinzetta dentale, strappa la pelle della palpebra lungo la fessura palpebrale per esporre il bulbo oculare del ratto. Tieni le pinzette sdentate aperte e parallele alla fessura palpebrale per premere verso il basso l'orbitale. Una volta raggiunto il nervo ottico e esposto il bulbo oculare, chiudere le pinzette per sollevare ed estrarre il bulbo oculare. Ora metti il bulbo oculare in un piatto di coltura di vetro con la soluzione di D-Hank. Sciacquare il bulbo oculare e trasferirlo in un altro piatto con la soluzione fresca di D-Hank. Quindi, utilizzando una micro pinza oftalmica curva, fissare delicatamente la regione tra la cornea e il nervo ottico per esporre la cornea. Forare la giunzione sclerale corneale utilizzando micro forbici corneali e tagliare lungo il limbus in modo circolare. Praticare due incisioni sclerali simmetriche di circa due millimetri di lunghezza prima di rilasciare la pinza e riserrare alla giunzione del nervo ottico e della sclera. Quindi, utilizzare una seconda pinza per premere delicatamente vicino alla radice del nervo ottico dirigendo la pressione verso l'interfaccia del nervo ottico corneale. Quando appare il tessuto del cristallino, rimuoverlo con cautela e continuare a premere fino a quando il tessuto retinico non emerge. Utilizzando una pinza, trasferire il tessuto retinico separato in un'altra piastra di coltura sterile. Aprire il coperchio del piatto di coltura e utilizzare una pipetta con una punta da un millilitro per pipettare il tessuto retinico su e giù circa 15 volte per romperlo in piccoli pezzi. Quindi, incubare il tessuto con un millilitro di tripsina allo 0,25% a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Estrarre il piatto di coltura dall'incubatrice e posizionarlo sul banco pulito. Aggiungere due millilitri di terreno completo e pipettare delicatamente per fermare la digestione. Ora filtrate la sospensione cellulare attraverso uno schermo di nylon da 300 maglie in una centrifuga da 15 millilitri due. Lavare la piastra di coltura con il PBS preparato e raccogliere la sospensione rimanente. Quindi centrifugare il tubo a 878 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in due millilitri di terreno completo e centrifugare nuovamente a 878 G per cinque minuti per purificare le cellule. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in due millilitri di terreno completo. Prendere un pallone T25 con tre millilitri di terreno completo e aggiungere un millilitro di sospensione cellulare. Agitare il pallone a croce prima di metterlo nell'incubatrice. Dopo 48 ore di incubazione, rimuovere il pallone dall'incubatrice e posizionarlo sul banco pulito. Scartare il terreno esaurito e lavare la superficie aderente alla cellula tre volte con un millilitro di PBS, che contiene l'1% di penicillina più streptomicina. Quindi aggiungere cinque millilitri di terreno fresco e completo e continuare l'incubazione fino a quando la confluenza cellulare non supera il 90%. Lavare le cellule tre volte con un millilitro di PBS contenente l'1% di penicillina streptomicina. Quindi incubare le cellule con un millilitro di soluzione di tripsina EDTA allo 0,25% per un minuto e 30 secondi. Ora, osservate il pallone al microscopio invertito. Quando le cellule appaiono rotonde, staccate e iniziano a galleggiare, aggiungere due millilitri di terreno di coltura completo al pallone per terminare la digestione. Quindi utilizzare una pipetta per aspirare la sospensione cellulare e trasferire l'intera sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Sciacquare la parete del pallone con due millilitri di PBS contenente l'1% di penicillina streptomicina e aggiungerlo allo stesso tubo. Centrifugare la provetta a 878 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di cella in un volume appropriato di terreno completo. Infine, far passare le celle in un rapporto di uno a due o uno a tre, a seconda delle necessità. Le cellule retiniche di Muller o RMC di secondo passaggio mostravano morfologie a forma di stella o fuso con nuclei rotondi o ovali e citoplasma abbondante. La colorazione con ematossilina ed eosina ha rivelato cellule a forma di fuso e stella con abbondante citoplasma rosa e nuclei ovali situati centralmente interconnessi da sottili strutture filamentose. La colorazione in immunofluorescenza degli RMC ha rivelato una forte fluorescenza rossa nelle cellule marcate per Glutammina Sintetasi e Acquaporina-4 e una fluorescenza verde brillante per CRALBP, Kir4.1 e Vimentina. NeuN, il controllo negativo non è stato rilevato nell'analisi di immunofluorescenza confermando la specificità dell'isolamento RMC. L'analisi citofluorimetrica ha mostrato che il 98,7% delle cellule era positivo per la glutammina sintetasi e il 97% era positivo per CRALBP, indicando un'elevata purezza delle RMC.