Definizione e analisi istologica di organoidi esofagei che modellano la progressione da tessuti normali a cancerosi
30 maggio 2025
Il presente protocollo descrive la costituzione e l'analisi istologica di modelli di organoidi esofagei che rappresentano diversi stadi di progressione tumorale. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella morfologia cellulare, nell'organizzazione spaziale e nei modelli di espressione dei marcatori molecolari durante la transizione dai tessuti normali a quelli cancerosi.
La nostra ricerca si concentra sull'inizio del tumore e sulla tumorigenesi precoce. Esaminiamo come le cellule normali si trasformano in cellule tumorali e come queste cellule modificano il loro microambiente per facilitare la tumorigenesi. Attualmente, ci sono molte tecnologie utilizzate per promuovere la ricerca, tra cui le tecnologie delle cellule staminali, le tecnologie di editing genetico, i sistemi avanzati di coltura 3D e i biomateriali e le tecnologie omiche a singola cellula e spaziale. La sfida più grande che dobbiamo affrontare è mantenere gli organoidi liberi da batteri e funghi. Questi contaminanti si insinuano durante la manipolazione e il trasporto dei tessuti, spesso rovinando le nostre colture.
[Istruttore] Per iniziare, scongelare la matrice della membrana basale e il terreno di coltura dell'organoide esofageo umano a quattro gradi Celsius. Trasferire il campione di tessuto in provette da centrifuga da cinque millilitri, quindi lavare il campione tre volte con un tampone di lavaggio a temperatura ambiente. Usando le forbici sterili, tritare il tessuto in frammenti di un millimetro cubo in provette da centrifuga da 1,5 millilitri. Ora, sospendere i frammenti di tessuto in un millilitro di tampone digestivo. Agitare la miscela a 37 gradi Celsius a 50-100 giri al minuto per 10-20 minuti per digerire il tessuto. Quindi, centrifugare la miscela a 400 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 500 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,025%. Incubare la sospensione a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aggiungere un millilitro di DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino per fermare l'attività enzimatica. Successivamente, passare la sospensione attraverso un filtro sterile da 70 micrometri e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare il filtrato per cinque minuti a 400 G a quattro gradi Celsius. Risospendere le cellule in 100 microlitri di H-EOCM dopo aver scartato il surnatante. Dopo aver risospeso le celle, determinare la densità delle celle utilizzando un contatore di celle. Quindi trasferire da 5.000 a 15.000 cellule per millilitro in una provetta fresca da 1,5 millilitri. Per la semina degli organoidi, risospendere delicatamente le cellule in 50-100 microlitri di matrice della membrana basale. Pipettare 50 microlitri della miscela di cellule della matrice al centro di ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti per polimerizzare la matrice della membrana basale. Ora pipettare 500 microlitri di H-EOCM preriscaldato in ogni pozzetto per coprire la matrice. Quindi incubare la piastra in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Per sostituire il fluido, aspirare il fluido esaurito. Rabboccare ogni pozzetto con 500 microlitri di H-EOCM fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius. Per eseguire la colorazione in immunofluorescenza multiplex su organoidi reparaffinizzati e reidratati. Aggiungere la soluzione anti-siero di pecora per coprire gli organoidi su un vetrino posto in una camera di umidità e incubare il vetrino a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare il vetrino con Tween contenente PBS per due minuti. Quindi, far cadere l'anticorpo primario diluito per coprire l'area dell'organoide. Incubare in una camera di umidità in base ai requisiti degli anticorpi. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini in PBS-T due volte per due minuti a 80 PMM in una camera termostabile. Ora versare la soluzione di anticorpi secondari sull'area dell'organoide e incubare in una camera di umidità a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini in PBS-T due volte per due minuti a 80 giri/min in una camera termostabile. Pipettare la soluzione di colorante fluorescente sul vetrino lavato per coprire l'area dell'organoide e incubare nuovamente. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini in PBS-T due volte. Per la colorazione multipla, il recupero ripetuto dell'antigene e il blocco degli anticorpi. Quindi versare la soluzione dappy per coprire l'area dell'organoide. Immergere i vetrini in acqua sterilizzata per due minuti per lavare via la macchia in eccesso. Aggiungere un supporto di montaggio anti-dissolvenza e applicare il vetrino coprioggetto prima di acquisire le immagini digitali. Le strutture degli organoidi sono diventate sempre più disorganizzate dagli stadi normali a quelli di carcinoma, come visualizzato dalla colorazione KRT6A. L'espressione di PDL1 è progressivamente aumentata dalla mucosa esofagea normale al carcinoma esofageo a cellule squamose.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'allestimento e l'analisi istologica di modelli di organoidi esofagei che riflettono diverse fasi della progressione tumorale. Consente ai ricercatori di studiare le variazioni nella morfologia cellulare, nell'organizzazione spaziale e nell'espressione dei marcatori molecolari dal tessuto normale a quello tumorale.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Ematologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- La ricerca si concentra sull'insorgenza tumorale e sulle fasi iniziali della tumorigenesi.
- Le cellule normali possono trasformarsi in cellule tumorali, alterando il loro microambiente.
- Le tecnologie utilizzate includono sistemi di coltura 3D, cellule staminali e tecnologie di editing genico.
- La contaminazione da batteri e funghi rappresenta una sfida durante la manipolazione dei tessuti.
Scopo dello studio
- Stabilire modelli di organoidi per lo studio del progresso tumorale.
- Analizzare i cambiamenti nelle caratteristiche cellulari e molecolari durante lo sviluppo del tumore.
- Fornire informazioni sulla transizione da tessuti normali a tessuti cancerosi.
Metodi Utilizzati
- Scongelamento della matrice della membrana basale e del mezzo di coltura.
- Lavaggio e digestione dei campioni di tessuto per creare colture di organoidi.
- Colorazione immunofluorescente multiplex per l'analisi istologica.
- Monitoraggio dei cambiamenti nella struttura degli organoidi e nell'espressione molecolare.
Risultati principali
- Le strutture organoidi hanno mostrato un crescente disordine passando da stadi normali a stadi di carcinoma.
- La colorazione per KRT6A ha permesso di visualizzare i cambiamenti morfologici.
- L'espressione di PDL1 è aumentata progressivamente passando da tessuti normali a tessuti cancerosi.
- Stabilimento con successo di colture organoidi prive di contaminazione.
Conclusioni
- Il protocollo consente uno studio dettagliato della progressione del tumore esofageo.
- L'analisi istologica fornisce informazioni sui cambiamenti cellulari durante la tumorigenesi.
- I modelli di organoidi sono preziosi per comprendere la biologia del cancro.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I modelli di organoidi esofagei umani consentono ai team biofarmaceutici di analizzare le transizioni cellulari e molecolari dallo stato normale a quello tumorale, sostenendo la previsione nell'ambito della scoperta oncologica precoce. L'analisi istologica quantitativa dell'architettura spaziale e dell'espressione dei biomarcatori fornisce informazioni utili per la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione dei rischi meccanicistici in punti critici del percorso di sviluppo. Questi modelli facilitano la continuità traslazionale collegando la biologia della scoperta con la valutazione preclinica delle ipotesi terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'interrogazione sistematica delle vie tumorogeniche e degli eventi di trasformazione cellulare.
- Consente la validazione funzionale di bersagli candidati mediante analisi biomolecolare spaziale e molecolare.
- Fornisce una riduzione dei rischi meccanicistica modellando la progressione della malattia in un sistema 3D controllato.
- Semplifica la selezione del portafoglio rivelando alterazioni molecolari specifiche per ogni stadio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi di organoidi validati per lo screening di composti e saggi fenotipici successivi.
- Standardizza letture istologiche e di immunofluorescenza per ottenere risultati quantitativi riproducibili.
- Consente un'analisi scalabile e multiplex dell'espressione dei biomarcatori attraverso diverse fasi tumorali.
- Permette una valutazione affidabile di interventi terapeutici in contesti rilevanti per la malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i cambiamenti dei biomarcatori derivati dagli organoidi agli endpoint traslazionali per studi preclinici.
- Mantiene la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica modellando la progressione tumorale.
- Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento corrette in base al rischio, basate su dati molecolari e morfologici quantitativi.
- Fornisce una previsione di riduzione del rischio per terapie candidate che mirano a percorsi del cancro dell'esofago.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di organoidi si integra nel percorso di scoperta oncologica, dalla validazione precoce del bersaglio alla ricerca preclinica, consentendo test ipotetici iterativi e decisioni guidate da biomarcatori.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'insorgenza e la progressione tumorale mediante analisi spaziali e molecolari.
- Screening: Fornisce risultati istologici e di immunofluorescenza riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Offre imaging digitale e misurazioni multiplex di biomarcatori per l'analisi comparativa di diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte della ricerca di base all'allineamento di biomarcatori preclinici e alla modellizzazione delle malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di organoidi riutilizzabile e adattabile a diverse fasi tumorali e studi di intervento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di coltura, colorazione e acquisizione delle immagini degli organoidi per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale nella ricerca e sviluppo oncologica.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione dei candidati terapeutici diretti contro il cancro dell'esofago, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare 3D, nell'istologia e nelle tecniche di immunofluorescenza.
- Richiede accesso a procedure sterili per la manipolazione dei tessuti, a infrastrutture avanzate per l'imaging e l'analisi.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per prevenire contaminazioni e garantire la qualità dei dati.
- È adattabile a diverse fasi tumorali e bersagli molecolari nella ricerca sul cancro dell'esofago.
- Il rischio di contaminazione durante la manipolazione dei tessuti rappresenta una limitazione pratica che richiede un rigoroso rispetto del protocollo.
