En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

La retina è un modello utile per comprendere i calcoli neuronali. Questi calcoli dipendono dalle posizioni speciali delle celle. Tuttavia, le mappe complete di questo sono rimaste sfuggenti.

Nell'ultimo decennio, il sequenziamento di singole cellule ha fornito descrizioni chiare dei tipi di cellule retiniche. Ora, la trascrittomica spaziale fornisce un nuovo modo per utilizzare queste descrizioni nei tessuti intatti. Una sfida critica per l'utilizzo della trascrittomica spaziale è che richiedono sezioni di tessuto molto sottili. La retina è già abbastanza sottile nel piano orizzontale che ci interessa.

Inventando questo metodo per creare sezioni sottili e veloci, utilizzare la trascrittomica spaziale nell'apprendimento automatico per mappare tutte le cellule gangliari retiniche nello stesso tessuto. Negli ultimi 30 anni, solo 17 delle 45 cellule gangliari retiniche dei topi sono state mappate e questa tecnica ci ha permesso di mapparle tutte in una volta.

[Istruttore] Per iniziare, posiziona un topo soppresso sul tavolo da lavoro. Ha fatto scorrere il polo temporale del globo sulla cornea per mantenere l'orientamento e creare un punto debole per la dissezione. Immergere il globo e puntare la soluzione in un piatto contenente un pezzo di carta da filtro. Con una pinza affilata numero cinque e forbici dell'iride rimuovi con cura tutta la muscolatura, la fascia, la vascolarizzazione e i nervi dal globo senza perforare la sclera. Posizionare la punta di una lama delle forbici dell'iride perpendicolarmente al marchio corneale. Forare il globo in questa posizione. Praticare un'unica incisione pulita attraverso la cornea e il limbus, proseguendo nella sclera e nella retina verso la testa del nervo ottico. Quindi posizionare la lama perpendicolarmente al taglio iniziale, circa un millimetro posteriormente al limbus. Inizia a tagliare radialmente attraverso la sclera e la retina. Mantenere una linea di taglio coerente posteriore e parallela al limbus utilizzando una pinza affilata per guidare e ruotare il globo. Se la retina e la sclera si separano, riposiziona la lama della forbice dell'iride per tagliarle insieme. Stimare la distanza posteriore di un millimetro utilizzando la larghezza media della lama della forbice dell'iride Dopo aver completato il taglio radiale parallelo al limbus, ispezionare le connessioni retiniche rimanenti. Tagliali con cura con le forbici dell'iride fino a quando le sezioni del globo anteriore e posteriore non sono separate. Quindi, usa due paia di pinze affilate numero cinque per separare delicatamente le parti anteriore e posteriore del globo. Nei topi più anziani, se le fibre trasparenti collegano la lente alla coppa retinica, reciderle accuratamente con le forbici dell'iride riducendo al minimo la separazione sclerale retinica. Usando la carta da filtro come piattaforma di supporto, taglia la retina in una foglia di trifoglio, chiamata anche motivo a croce di ferro con le forbici Iris. Ripetere la dissezione con il secondo occhio. Tagliare la punta di una pipetta di trasferimento in plastica monouso per creare un'apertura più grande della retina e della sclera sezionate. Aspirare delicatamente la retina nella pipetta e depositarla su un vetrino da microscopio. Con una salvietta da laboratorio, rimuovere la soluzione di mira in eccesso fino a quando la retina non galleggia più e può essere appiattita. Ora usa due pinze numero cinque affilate per aprire la retina e posizionarla in piano con l'oculare interno rivolto verso l'alto. Eseguire tagli in rilievo lunghi da 0,5 a due millimetri in ciascun segmento di rilievo del trifoglio per facilitare l'appiattimento e regolare per evitare la piegatura. Rimuovere l'eventuale soluzione di mira rimanente, ad eccezione del liquido adiacente alla retina. Utilizzando un vetrino coprioggetti, premere e trasferire rapidamente la retina in modo che la sclera esterna sia rivolta verso l'alto e la conchiglia oculare interna sia a contatto con il vetrino coprioggetti. Verificare che la retina non sia piegata e apportare modifiche se necessario. Aggiungere la soluzione di mira per facilitare la manipolazione, ma rimuovere l'eccesso con una salvietta per evitare l'arricciatura e lasciare asciugare all'aria per cinque-10 secondi. Ora applica il terreno OCT per coprire la retina. Quindi utilizzare una pinza per distribuire uniformemente lo strato sul vetrino coprioggetti per evitare il galleggiamento. Congelare la retina in mezzo OCT utilizzando una piastra metallica raffreddata con vapore di azoto liquido o contattando direttamente il ghiaccio secco. Conservare la retina congelata su ghiaccio secco per un uso immediato. Per la criosezione, creare una cupola OCT sul mandrino del campione, occupando i due o tre anelli interni se si utilizza lo stesso modello di criostato. Allineare il mandrino del campione in piano alla superficie di taglio. Creare o annotare la guida di orientamento che collega il mandrino allo stadio del criostato. Quindi tagliare la cupola per formare una superficie piana parallela alla lama. Con una lametta rimuovere lateralmente l'OCT in eccesso e separare accuratamente la retina dal vetrino coprioggetti per renderlo mobile. Rimuovere il mandrino dal tavolino e applicare una piccola goccia di OCT liquido sulla superficie piatta dell'OCT preparata. Quindi, posiziona la retina direttamente sull'OCT liquido. Usa un vetrino di vetro pre-raffreddato per premere e tenere premuta la retina fino a quando non si congela. Applicare più OCT sulla retina e sul mandrino per garantire l'adesione. Quindi congelare l'assemblaggio nell'area di congelamento rapido del criostato. Per il sezionamento, tagliare con cura l'OCT in eccesso fino a quando la retina non è visibile. Usa una lama di rasoio per modellare i bordi del blocco OCT vicino alla retina. Continuare a tagliare mentre si ispeziona la presenza di sclera. Quando la sclera è visibile, regolare l'angolazione del tavolino in base alle esigenze. Interrompere il taglio quando la sclera è distribuita approssimativamente in modo uniforme tra le sezioni. Ora, usa diapositive pre-raffreddate e due pennelli per manipolare le sezioni e raccoglierle. Posizionare un dito sotto la sezione per circa cinque secondi fino a quando l'OCT non si scioglie e aderisce il tessuto al vetrino. Quindi riposizionare il vetrino su una superficie fredda per il ricongelamento. Conservare i vetrini preparati su ghiaccio secco per un uso immediato. L'immunoreattività distinta o RBPMS nello strato di cellule gangliari e la chiara separazione del plesso vascolare marcato dalla lectina di pomodoro hanno confermato il successo della conservazione della laminazione retinica e dei marcatori proteici. Il rilevamento multiplex dell'RNA utilizzando un pannello RNA Scope a 12 plessi ha mantenuto con successo la struttura spaziale e ha rivelato un'espressione distinta di marcatori come Grm6 e RBPMS in tutta la fetta sul viso. Le immagini ad alta risoluzione hanno confermato i modelli di espressione di singole cellule per RBPMS e altri marcatori come Mafb6 e Meis2, convalidando la localizzazione sia di proteine che di RNA nello strato di cellule ganglionari. La distribuzione uniforme del segnale tra le sezioni di foglie di trifoglio e i segnali forti nei dati trascrittomici spaziali dello xinio hanno confermato il successo della profilazione ad alto rendimento e l'integrità dell'RNA. La visualizzazione della risoluzione di una singola cella utilizzando lo xenio corrispondeva a modelli di rilevamento manuale che confermavano la robustezza del protocollo su tutte le piattaforme. I marcatori di trascrizione specifici per tipo di cellula hanno mostrato una distribuzione laminare stratificata nella sezione trasversale retinica e sulla mappatura del volto, preservando la loro posizione in profondità. Lo zoom dettagliato nello strato di cellule gangliari ha confermato un'accurata rilevazione del trascritto spaziale rispetto alla colorazione nucleare DAPI.