Imaging ad alta risoluzione di C. elegans in tutti gli stadi larvali

In laboratorio lavoriamo su tutti i tipi di questioni di biologia dello sviluppo. Io stesso lavoro più sul lato tecnico, sviluppando metodi per affrontare meglio queste domande utilizzando tecniche di imaging. Il campo di C. elegans ha adottato con successo un'enorme varietà di metodi, che vanno dall'editing genetico CRISPR, alla trascrittomica e alla proteomica, fino alla microscopia a super risoluzione. C. elegans è un modello straordinario, tuttavia, nel contesto dell'osservazione in vivo ad alta risoluzione, presenta le sue sfide, richiedendo l'immobilizzazione per la migliore risoluzione, che a sua volta limita la vitalità degli animali. Il protocollo presenta una possibile soluzione per l'imaging a lungo termine di C. elegans, consentendo ai ricercatori di adottare il metodo nel proprio laboratorio e studiare un'ampia varietà di processi di sviluppo dinamico direttamente in vivo. All'interno del laboratorio, il metodo ha permesso un'osservazione dettagliata della formazione degli organi, ad esempio, nel contesto della morfogenesi o in seguito alle divisioni cellulari somatiche nell'età adulta. Da allora il metodo è stato adottato da numerosi laboratori che studiano una vasta gamma di processi di sviluppo.

[Presentatore] Per iniziare, fissare il dispositivo al telaio di supporto e montarlo sul microscopio verticale. Riempi una siringa con acqua deionizzata, quindi collega un ago calibro 23 e un lungo pezzo di tubo da 16 pollici con un perno d'acciaio piegato cavo. Riempire il tubo con acqua deionizzata dalla siringa e inserire il perno d'acciaio nel foro perforato dell'ingresso della valvola per collegare il tubo. Rimuovere la siringa e l'ago prima di collegare il tubo al solenoide off-chip. Utilizzando il software di imaging, accendere il solenoide e pressurizzare il dispositivo per diversi minuti per espellere tutta l'aria dalla valvola. Verificare il completamento controllando visivamente che l'interfaccia aria-acqua appaia scura e scompaia nel materiale PDMS. Spegnere il solenoide utilizzando il software di imaging. Quindi, riempi una siringa da un millilitro con la soluzione batterica filtrata e collega un ago calibro 30 e un lungo pezzo di tubo da 32 pollici all'ago. Premere lo stantuffo per riempire sia l'ago che il tubo collegato con la soluzione batterica. Quindi, utilizzando una pinzetta, inserire il tubo da 32 pollici direttamente nell'ingresso del cibo del dispositivo microfluidico e posizionare la siringa sulla pompa a siringa. Premere lo stantuffo della siringa utilizzando la vite a testa zigrinata sul retro per riempire il dispositivo di liquido. Bloccare sia l'ingresso che l'uscita della vite senza fine con perni in acciaio sigillati e applicare una pressione aggiuntiva utilizzando la vite di fermo per rimuovere l'aria residua dal dispositivo. Quindi rimuovere il perno d'acciaio bloccato all'uscita e fissare il contenitore dei rifiuti all'uscita. Spingere la siringa per assicurarsi che il contenitore dei rifiuti sia collegato correttamente e che non vi siano ostruzioni nel sistema. Rimuovere il secondo perno d'acciaio ostruito dall'ingresso e spingere la siringa fino a quando non appare una piccola goccia di liquido all'ingresso della vite senza fine. Quindi, utilizzando un ago calibro 23, collegare un pezzo più lungo di un tubo da 16 pollici di circa 15-20 centimetri a una siringa da un millilitro riempita con tampone S-basale. Fissare un perno d'acciaio dritto calibro 23 all'altra estremità del tubo. Riempire l'ago e il tubo con il tampone S-basale della siringa. Ora, inserisci il perno d'acciaio all'estremità del tubo nel tubo contenente le viti senza fine e spingi una piccola quantità di liquido attraverso il tubo per assicurarti che non rimanga aria. Tirare i vermi nel tubo senza tirarli nella siringa. Quindi spingere la siringa collegata alle viti senza fine fino a quando non appare una piccola goccia di liquido sul perno d'acciaio e inserire il perno d'acciaio nell'ingresso della vite senza fine del dispositivo microfluidico. Posizionare il dispositivo su un microscopio a basso ingrandimento, 5x o 10x, o su un microscopio da dissezione. Posizionare il dispositivo in modo che l'ingresso sia visibile su un lato del campo visivo e la parte posteriore dell'ingresso del canale di sifone sia visibile sull'altro lato. Spingere delicatamente lo stantuffo della siringa a vite senza fine. Quindi, spingi gli animali verso l'array di canali. Una volta che un animale si trova di fronte al canale, spingilo nel canale e ripeti per altri animali. Dopo aver intrappolato un numero sufficiente di animali, posizionare la siringa, ancora attaccata all'ingresso del verme sul tavolino del microscopio, dove rimarrà per tutta la durata dell'esperimento. Se il caricamento è stato eseguito su un microscopio da dissezione, trasferire il dispositivo al microscopio per immagini. Ora, accendi la pompa a siringa e falla funzionare a una velocità preimpostata di un microlitro all'ora per 0,5 microlitri. Programmare la pompa a siringa in modo che funzioni a un microlitro all'ora per 0,5 microlitri, dopodiché la portata viene aumentata di 100 microlitri all'ora per 0,5 microlitri e il modello di flusso viene ripetuto per tutto l'esperimento. Posizionare il dispositivo sul tavolino del microscopio e assicurarsi che sia tenuto saldamente. Passa all'ingrandimento dell'immagine desiderato. Identifica gli animali e le regioni di interesse all'interno dell'array di canali trappola e imposta le condizioni di imaging desiderate. Immagine alle condizioni di imaging desiderate, azionando la valvola on-chip attraverso il solenoide 10 secondi prima dell'acquisizione dell'immagine in modo che gli animali siano tenuti in posizione. Il dispositivo microfluidico ha mantenuto un'elevata qualità di imaging in varie modalità di microscopia, tra cui campo chiaro, epifluorescenza, confocale a disco rotante e metodi di super risoluzione grazie all'uso di un vetro di copertura spesso 170 micrometri. Sviluppo delle cellule epiteliali di Caenorhabditis elegans visualizzate dallo stadio larvale L1 iniziale a quello L2 medio. Era evidente l'induzione delle cellule precursori primarie della vulva sbiadita e le loro successive divisioni dalla fine di L1 allo stadio larvale precoce di L4. Fasi di formazione della vulva dall'inizio di L3 all'età adulta. Le immagini acquisite sono state migliorate attraverso la deconvoluzione e la registrazione delle immagini, migliorando la chiarezza visiva Le divisioni cellulari osservate si sono verificate in modo coerente e tempestivo in tutti gli animali, con tutte le divisioni completate entro la durata tipica degli stadi larvali. La lunghezza delle gonadi è aumentata costantemente durante gli stadi L2 e L3 con misurazioni coerenti abilitate dall'orientamento rettilineo degli animali.