Name: Spatola Montevideo Dispositivo per la vitrificazione di embrioni di mammiferi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Scopri il protocollo Spatola Montevideo per la vitrificazione di embrioni pre-impianto di topo e pecora. Questo metodo economico utilizza strumenti artigianali e crioprotettori per preservare gli embrioni con alte percentuali di sopravvivenza.

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Gli animali utilizzati per ottenere embrioni di topo sono stati alloggiati e gestiti secondo la legge nazionale 18.611 e le linee guida internazionali per la cura degli animali11. Il protocollo sperimentale (numero di permesso #007-18) è stato opportunamente approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Institut Pasteur de Montevideo (è stato dato il consenso scritto). I protocolli sperimentali per ovociti/embrioni di pecora sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura degli Animali Fundación IRAUy (protocollo #001-2017), conformi alle linee guida ARRIVE12 e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida internazionali per la cura degli animali11.
1. Vitrificazione (Figura 2)
<ol>
	<li>Spatola MVD preparazione<ol>
		<li>Accorciare la punta del gel-loader (vedi Tabella dei materiali) tagliando i primi 10 mm e il cono della punta. NOTA: In questo modo si crea una punta più corta e diritta, facilitando la sigillatura finale con la cannuccia da 0,5 ml (vedere la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Tenere l'estremità della punta del caricatore di gel con la pinza #5 dell'orologiaio (vedi Tabella dei materiali) a circa 1,0 cm dalla punta. Posizionare delicatamente la punta nella fiamma di un bruciatore Bunsen (vedi Tabella dei materiali) e tenere premuto per 8-10 s fino a formare una piattaforma simile a un petalo di circa 1 mm2.</li>
		<li>Togliere dal fuoco e tenere forte con la pinza per 5 s.</li>
		<li>Utilizzando uno stereomicroscopio (vedi Tabella dei materiali), verificare che la piattaforma a forma di petalo (~ 1 mm2) sia formata e che il bordo distale sia sigillato. NOTA: La piattaforma deve essere chiusa all'estremità distale per evitare l'infiltrazione di LN2 durante la vetrificazione. Assicurarsi che la piattaforma sia pulita e priva di fili di plastica. Se è troppo piccola o ha dei fili, tagliare la punta e ripetere la procedura.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.1.1-1.1.4 per preparare il numero necessario di spatole (1 spatola = fino a 40 embrioni di topo).</li>
		<li>Sterilizzare le spatole utilizzando raggi ultravioletti (UV) o ossido di etilene e conservarle in una provetta o scatola sterile.</li>
		<li>Il giorno della vetrificazione, recuperare le spatole, maneggiandole dall'estremità opposta della piattaforma. Inserire un'asta di identificazione (vedi Tabella dei materiali) in ciascuna spatola e posizionarla sulla base dello stereomicroscopio. Etichettare l'asta con un pennarello indelebile o un'etichetta adesiva resistente all'azoto liquido. NOTA: Evitare sempre di toccare la piattaforma quando si maneggiano le spatole. La lunghezza totale dell'intero dispositivo (spatola + 0,5 ml di cannuccia + asta di identificazione) non deve superare 1 cm della lunghezza del calice.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione di soluzioni di vitrificazione<ol>
		<li>Preparare la soluzione FS: Sciogliere 1,5 g di terreno con gradiente di densità (vedere la Tabella dei Materiali) e 0,85 g di saccarosio (vedere la Tabella dei Materiali) in 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; vedere la Tabella dei Materiali). Scaldare a bagnomaria bollente fino a completa dissoluzione, quindi sterilizzare con un filtro da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali). NOTA: Questa soluzione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
		<li>Preparare la soluzione di pre-vitrificazione (PV): il giorno della vetrificazione, miscelare il 10% di glicole etilenico (vedere la Tabella dei Materiali), il 10% di dimetilsolfossido (vedere la Tabella dei Materiali) e l'80% di M2 di terreno (vedere la Tabella dei Materiali). Per 5 spatole è necessario un volume totale di 100 μl.</li>
		<li>Preparare la soluzione di vitrificazione (V): il giorno della vetrificazione, combinare il 15% di glicole etilenico, il 15% di dimetilsolfossido, il 10% di terreno M2 e la soluzione di FS al 60%. Per 5 spatole è necessario un volume totale di 100 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Processo di disidratazione e vitrificazione degli embrioni<ol>
		<li>Preparare LN2: Versare LN2 in un contenitore adatto (ad esempio, un contenitore di polistirene isolato di 10 cm x 30 cm x 20 cm) e posizionare tante cannucce da 0,5 ml quante sono le spatole da utilizzare. NOTA: Per facilitare la visualizzazione della piattaforma della spatola durante la manipolazione sotto LN2, si suggerisce di utilizzare un contenitore di polistirene isolato con fondo colorato per creare un effetto di contrasto. ATTENZIONE: Indossare occhiali e guanti adeguati (vedere la tabella dei materiali) quando si maneggia LN2.</li>
		<li>Preparare le soluzioni: Su una piastra di Petri di plastica da 100 mm (vedi Tabella dei materiali), posizionare le seguenti gocce: 100 μl di M2, 20 μl di soluzione PV e 20 μl di soluzione V per ogni spatola.</li>
		<li>Vitrificare gli embrioni: Posizionare gli embrioni da vitrificare nella goccia M2. Maneggiare 30-40 embrioni alla volta, incubandoli nella goccia di soluzione PV per 30 s, e poi nella goccia di soluzione V per altri 30 s a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Utilizzare un capillare di vetro tirato (vedi Tabella dei materiali) con un tubo aspiratore (vedi Tabella dei materiali). Precaricare il capillare con almeno 1 μL della rispettiva soluzione prima di posizionare gli embrioni. NOTA: Gli embrioni saranno a diverse altezze nelle gocce, quindi regola il micrometro dello stereomicroscopio per localizzarli. Recupera gli embrioni da ogni goccia quando rimangono 10 s. Tutte le manipolazioni degli embrioni devono essere condotte allo stereomicroscopio.</li>
		<li>Caricare gli embrioni: aspirare gli embrioni utilizzando una soluzione di V minima (ad es. ~ 0,1 μL) e posizionarli rapidamente sulla piattaforma della spatola.</li>
		<li>Immersione in LN2: Dopo aver caricato gli embrioni, immergere immediatamente la piattaforma della spatola in LN2 per 5 s (tenendo la spatola a mano, per l'asta). Quindi, mantenendo la spatola nei vapori di LN2 , sigillarla con una cannuccia da 0,5 ml utilizzando una pinzetta lunga in acciaio inossidabile (vedi Tabella dei materiali). NOTA: Rimuovere LN2 dalla cannuccia prima di sigillare per evitare l'espansione durante il riscaldamento. Assicurati che la spatola e la cannuccia siano allineate correttamente per evitare il contatto tra la goccia dell'embrione e la parete della paglia. Per comodità, le spatole sigillate possono rimanere nel contenitore LN2 fino a quando tutte le spatole non sono caricate con embrioni, riempiendole nuovamente con LN2 se necessario.</li>
		<li>Ripetere la procedura: Ripetere i passaggi da 1.3.3 a 1.3.7 per ogni gruppo di embrioni, utilizzando un paio di gocce PV e V fresche.</li>
		<li>Stoccaggio: Trasferire le spatole nei calici (vedi Tabella dei materiali) e poi in un dewar di stoccaggio LN2 (vedi Tabella dei materiali).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig02.jpg"> 
Figura 2: Schema del processo di vetrificazione utilizzando Spatola MVD. Si veda il testo per maggiori dettagli. Creato in BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Riscaldamento (Figura 3)
<ol>
	<li>Preparazione della soluzione<ol>
		<li>Preparare una soluzione di saccarosio 1 M sciogliendo 0,85 g di saccarosio in 2,5 mL di terreno M2. Sterilizzare la soluzione con un filtro da 0,22 μm. NOTA: Questa soluzione può essere preparata e conservata a 4 °C per un massimo di 1 settimana.</li>
		<li>Preparare le soluzioni di saccarosio 0,5 M e 0,25 M diluendo la soluzione di saccarosio 1 M con il volume appropriato di terreno M2.</li>
		<li>Mantenere le soluzioni di saccarosio a 37 °C su una piastra calda (vedi Tabelle dei materiali) fino all'inizio del riscaldamento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione della piastra riscaldante<ol>
		<li>Su una piastra di Petri di plastica da 100 mm, posizionare le seguenti gocce di soluzione: una goccia da 500 μl di saccarosio 0,5 M, una goccia da 50 μl di saccarosio 0,5 M e una goccia da 50 μl di saccarosio 0,25 M per ogni spatola da riscaldare. Mettere tre gocce di terreno M2 (100 μl ciascuna) per il lavaggio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Processo di riscaldamento NOTA: Il processo di riscaldamento avviene a RT, ad esempio 20-22 °C sulla base di uno stereomicroscopio.<ol>
		<li>Recupera le spatole sigillate dal dewar. Metterli in un contenitore appropriato con LN2. Vedere la Figura 3.</li>
		<li>Posizionare la piastra riscaldante sullo stereomicroscopio. Uno alla volta, afferra la base della spatola con una pinzetta in acciaio inossidabile e, con una mano guantata, estrai l'asta di identificazione e poi la cannuccia. Immergi rapidamente la piattaforma contenente gli embrioni nella goccia di saccarosio 0,5 M da 500 μl.</li>
		<li>Assicurarsi che tutti gli embrioni siano caduti nella goccia; Se necessario, muovere delicatamente la spatola per favorirne il rilascio. Caricare gli embrioni in un capillare di vetro tirato, metterli nella goccia da 50 μl di soluzione di saccarosio 0,5 M e incubare per 2 minuti.</li>
		<li>Immergere gli embrioni nella goccia da 50 μl di soluzione di saccarosio 0,25 M e incubare per altri 2 minuti. NOTA: Prima di inserire gli embrioni in ogni soluzione, precaricare il capillare con la soluzione da utilizzare.</li>
		<li>Infine, lavare gli embrioni tre volte in diverse gocce di terreno M2 per rimuovere il saccarosio.</li>
		<li>Incubare gli embrioni in condizioni appropriate per ciascuna specie per almeno 1 ora prima dell'uso.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig03.jpg"> 
Figura 3: Schema del processo di riscaldamento MVD della spatola. Si veda il testo per maggiori dettagli. Creato in BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<ol><li>Crispo, M., Meikle, M. N., Rülicke, T. Cryopreservation of Valuable Mouse and Rat Lines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrispo%2C+M+%22Rodent+Quality+Control%3A+Genes+and+Bugs.+Laboratory+Animal+Science+and+Medicine%22">Rodent Quality Control: Genes and Bugs. Laboratory Animal Science and Medicine</a>. , Springer. Cham. (2024).</li>
<li>Lloyd, K., Franklin, C., Lutz, C., Magnuson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+use+mouse+biobanks+or+lose+them%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: use mouse biobanks or lose them.</a> Nature. 522 (7555), 151-153 (2015).</li>
<li>Hart-Johnson, S., Mankelow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archiving+genetically+altered+animals%3A+a+review+of+cryopreservation+and+recovery+methods+for+genome-edited+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Archiving genetically altered animals: a review of cryopreservation and recovery methods for genome-edited animals.</a> Lab Anim. 56 (1), 26-34 (2022).</li>
<li>Shaw, J. M., Jones, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology+associated+with+vitrification+and+other+cryopreservation+procedures+for+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos.</a> Hum Reprod Update. 9 (6), 583-605 (2003).</li>
<li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li>
<li>dos Santos Neto, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryotolerance+of+Day+2+or+Day+6+in+vitro+produced+ovine+embryos+after+vitrification+by+Cryotop+or+Spatula+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryotolerance of Day 2 or Day 6 in vitro produced ovine embryos after vitrification by Cryotop or Spatula methods.</a> Cryobiology. 70 (1), 17-22 (2015).</li>
<li>Renard, J. P., Babinet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+of+mouse+embryos+after+rapid+freezing+and+thawing+inside+plastic+straws+with+1-2+propanediol+as+cryoprotectant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">High survival of mouse embryos after rapid freezing and thawing inside plastic straws with 1-2 propanediol as cryoprotectant.</a> J Exp Zool. 230 (3), 443-448 (1984).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+cryopreservation+utilizing+a+novel+high-capacity+vitrification+spatula%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo cryopreservation utilizing a novel high-capacity vitrification spatula.</a> Biotechniques. 46 (7), 550-552 (2009).</li>
<li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos%3A+the+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).</li>
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<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).</li>
<li>du Sert, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARRIVE+guidelines+2.0%3A+Updated+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).</li>
<li>Meikle, M. N., Schlapp, G., Menchaca, A., Crispo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+volume+Spatula+MVD+vitrification+method+improves+embryo+survival+compared+to+traditional+slow+freezing%2C+both+for+in+vivo+and+in+vitro+produced+mice+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Minimum volume Spatula MVD vitrification method improves embryo survival compared to traditional slow freezing, both for in vivo and in vitro produced mice embryos.</a> Cryobiology. 84, 77-81 (2018).</li>
<li>Momozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+vitrification+of+mouse+embryos+using+the+Kitasato+Vitrification+System+as+a+novel+vitrification+device%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Efficient vitrification of mouse embryos using the Kitasato Vitrification System as a novel vitrification device.</a> Reprod Biol Endocrinol. 15 (1), 29(2017).</li>
<li>Stringfellow, D. A., Givens, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStringfellow%2C+DA+%22Manual+of+the+International+Embryo+Transfer+Society%3A+A+Procedural+Guide+and+General+Information+for+the+use+of+Embryo+Transfer+Technology+Emphasizing+Sanitary+Procedures%22">Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the use of Embryo Transfer Technology Emphasizing Sanitary Procedures</a>. , International Embryo Transfer Society. (2010).</li>
<li>Dos Santos-Neto, P. C., Cuadro, F., Barrera, N., Crispo, M., Menchaca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+survival+and+birth+rate+after+minimum+volume+vitrification+or+slow+freezing+of+in+vivo+and+in+vitro+produced+ovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Embryo survival and birth rate after minimum volume vitrification or slow freezing of in vivo and in vitro produced ovine embryos.</a> Cryobiology. 78, 8-14 (2017).</li>
<li>Schlapp, G., Meikle, M. N., Pórfido, J. L., Menchaca, A., Crispo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygote+cryobanking+applied+to+CRISPR%2FCas9+microinjection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zygote cryobanking applied to CRISPR/Cas9 microinjection in mice.</a> PLoS One. 19 (7), e0306617(2024).</li>
<li>Kamoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+oocyte%2Fembryo+vitrification+in+mammals+from+rodents+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Sci+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances of oocyte/embryo vitrification in mammals from rodents and large animals.</a> Anim Sci J. 95 (1), e13931(2024).</li>
<li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos+using+low+concentrations+of+cryoprotectants%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos using low concentrations of cryoprotectants.</a> Cryobiology. 98, 127-133 (2021).</li>
<li>Tsang, W. H., Chow, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+embryos%3A+Advancement+of+putting+life+on+hold%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian embryos: Advancement of putting life on hold.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 163-175 (2010).</li>
</ol>

L'efficienza della generazione animale geneticamente modificata (GM) è aumentata in modo significativo grazie allo sviluppo di metodi basati sull'endonucleasi, in particolare CRISPR/Cas9. Molti laboratori in tutto il mondo producono varie linee di topi e ratti geneticamente modificati che dovrebbero essere crioconservate per prevenire la deriva genetica e mantenere l'integrità del fenotipo originale1. Inoltre, l'archiviazione elimina la necessità di un allevamento costante, che spesso si traduce in un numero eccessivo di animali. Alcuni laboratori inviano linee di topi GM come embrioni o spermatozoi crioconservati a depositi internazionali, facilitando lo scambio di questi modelli ed evitando il trasporto di animali vivi. Ciò garantisce l'accessibilità alle linee senza la generazione ripetitiva di modelli di animali GM identici2. Per questi motivi, la crioconservazione di embrioni e spermatozoi è fondamentale in qualsiasi struttura per animali geneticamente modificati. In generale, la crioconservazione degli embrioni è preferita per la conservazione delle linee GM perché gli embrioni contengono il genoma diploide completo con modifiche e possono essere facilmente recuperati tramite trasferimento embrionale.
La vitrificazione è un processo di non equilibrio caratterizzato da uno squilibrio tra l'acqua che entra nella cellula e l'acqua che forma cristalli extracellulari attorno ad essa. Questo metodo previene la formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari, distinguendolo dal metodo di congelamento lento (SLF)3 (vedi Figura 1). L'alta concentrazione di crioprotettori e il contatto diretto con l'azoto liquido (LN2) consentono un raffreddamento ultrarapido (~40 °C/s), raggiungendo uno stato vitreo dei campioni in pochi secondi. Inoltre, la vitrificazione è più veloce, più facile e meno costosa del congelamento lento4. Richiede un LN2 minimo e in genere impiega apparecchiature semplici che possono essere acquistate commercialmente o fatte in casa5 (vedi Figura 1).
Inoltre, il processo di riscaldamento è generalmente veloce e replicabile. Dovrebbe essere eseguito rapidamente per evitare la tossicità del crioprotettore e per mantenere lo stato vitreo3. Quando si congelano gli embrioni, molti laboratori considerano la comodità del dispositivo portante, la sua affidabilità, robustezza, capacità di tenuta e costi.
Preferiamo il metodo di vitrificazione a spatola a volume minimo per la crioconservazione di routine di embrioni di ovini e topi, utilizzando il dispositivo Spatola Montevideo (MVD)6. Inizialmente, abbiamo impiegato il metodo di congelamento lento7 , ma siamo passati rapidamente alla vitrificazione. Per creare un dispositivo più semplice ed efficiente in termini di spazio per il dewar LN2 , abbiamo modificato la spatola fatta in casa da Tsang e Chow (2009)8, che è collegata a un criotubo, per sviluppare la spatola MVD che è sigillata con una cannuccia da 0,5 ml (vedi Tabella dei materiali). La spatola è dotata di una punta di caricamento del gel (vedi Tabella dei materiali), dove una piattaforma di circa 1 mm² è formata fondendo delicatamente la punta con una pinza fine, creando una piastra simile a un petalo per caricare gli embrioni. Questa piattaforma può ospitare fino a 40 embrioni di topo in una piccola goccia di vitrificazione. Un'asta di identificazione (vedi Tabella dei materiali) è inserita nell'estremità aperta della punta del caricatore di gel.
Lo scopo di questo metodo è quello di vitrificare gli embrioni in un metodo semplice, veloce ed economico che, inoltre, consente di risparmiare spazio nel dewar con azoto. Questo sistema è stato utilizzato con successo per molti anni, fornendo eccellenti tassi di sopravvivenza embrionale (~97%) e risultati riproduttivi, in particolare negli embrioni di topo. Poiché la spatola MVD viene preparata in laboratorio, è un metodo a basso costo rispetto ai dispositivi commerciali9. Inoltre, consente di risparmiare spazio nel dewar con azoto rispetto all'uso di criotubi 8,10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68176/68176fig01.jpg"> 
Figura 1: Confronto tra le due principali tecniche utilizzate per la crioconservazione degli embrioni. Questa figura è stata modificata con il permesso di Crispo et al.1. Creato nel BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68176/68176fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filtro&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Filtro per siringa Minisart 0,2 & micro; L</td></tr><tr><td>0,5 ml di cannuccia</td><td>Minitubo</td><td>13408/0044</td><td>Paillette media di tipo francese</td></tr><tr><td>Assemblaggio tubo aspiratore&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Codice: A5177</td><td></td></tr><tr><td>Bruciatore Bunsen&nbsp;</td><td>Indulab</td><td>7000134</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM70&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F2878</td><td>Gradiente di densità medio</td></tr><tr><td>Punta per il caricamento del gel</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>10411193</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro&nbsp;</td><td>Marienfeld</td><td>2900000</td><td>Tubo capillare per microematocrito</td></tr><tr><td>Guanti per movimentazione LN2&nbsp;</td><td>Scudo temporaneo</td><td>CE0338</td><td>Guanti criogenici</td></tr><tr><td>Calici</td><td>Minitubo</td><td>16913/1133</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali per la movimentazione LN2&nbsp; &nbsp;</td><td>3M</td><td>&nbsp; 40661-00000-10</td><td>Rivestimento antiappannamento e antigraffio</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Labec</td><td>LA-SH-II-5B</td><td>Modello digitale</td></tr><tr><td>Asta di identificazione&nbsp;</td><td>Tecnologie IMV</td><td>6326</td><td>Non steril LG48 mm</td></tr><tr><td>Contenitore isolato in polistirolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dewar di stoccaggio LN2</td><td>Taylor-Wharton</td><td>XT21-AI</td><td>Crioscienza</td></tr><tr><td>Pinzette lunghe in acciaio inox</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11000-25</td><td></td></tr><tr><td>M2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Codice: M7167</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Casareccio</td><td></td><td>Soluzione salina tamponata con fosfato. Di solito viene preparato 1 litro di tampone concentrato 5x e poi diluito a 1x. Ricetta: 40 g di cloruro di sodio, 1 g di cloruro di potassio, 7,2 g di fosfato disodico anidro, 1,2 g di fosfato monopotassico. Aggiungere acqua distillata e sterilizzare in autoclave.</td></tr><tr><td>Piastra di Petri in plastica&nbsp;</td><td>Falcone</td><td>&nbsp; &nbsp; 351029</td><td>Piastra di Petri batteriologica non trattata con TC</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio&nbsp;</td><td>Olimpo</td><td>SZ2-LGB</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Orologiaio' S #5 Pincipe&nbsp;</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11254-20</td><td></td></tr></tbody></table>

spatola montevideo dispositivo per la vitrificazione di embrioni di mammiferi

Spatula Montevideo Device for the Vitrification of Mammalian Embryos

Spatola Montevideo Dispositivo per la vitrificazione di embrioni di mammiferi

This study describes an efficient and cost-effective vitrification method for mouse and sheep embryo cryopreservation known as the Spatula Montevideo ...

Per generare modelli murini geneticamente modificati e quindi crioconservare le linee come backup. Per questo, abbiamo bisogno di un metodo semplice, economico, efficiente e riproducibile per vitrificare gli embrioni. La microiniezione o l'elettroporazione di CRISPR-Cas9 potrebbe essere effettuata in zigoti vitrificati, di topo e di bestiame, con conseguente programma più flessibile e riduzione degli animali in uso.La vitrificazione degli embrioni utilizza un raffreddamento ultrarapido per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio, preservando l'integrità cellulare. Questa tecnica fa progredire la ricerca criobiologica, consentendo studi sulla vitalità dell'embrione, sulla stabilità genetica e sui risultati di conservazione a lungo termine. Sia la spatola MVD che le soluzioni sono fatte in casa. La spatola è sigillata con una cannuccia da 0,5 millilitri, che occupa uno spazio minimo nell'azoto liquido Dewar.[Istruttore] Per iniziare, taglia i primi 10 millimetri e il cono della punta di una punta del caricatore di gel. Utilizzando la pinza numero cinque dell'orologiaio, tenere l'estremità della punta del caricatore di gel a circa un centimetro dalla punta e posizionarla deli

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Il pulcino corioallantoidea membrana (CAM) è un ambiente unico e naturalmente immunodeficienti cultura di sostegno allo studio dell'angiogenesi e tumorigenesi. In questo articolo video mostra le varie fasi...

Pulcino Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM saggio: Come funziona veramente

Questo video descrive l'iniezione pronucleare di vettori lentivirali nello spazio perivitellino di un embrione di topo fecondato. Il lentivirus contiene il transgene, che viene incorporato nel genoma dell'embrione fecondato, dando infine origine a topi transgenici.

Iniezione di perivitellina basata su vettori lentivirali: un metodo per trasdurre il gene di interesse in ovociti fecondati di topo unicellulare

Utero-tubarico trasferimento di embrioni utilizza la giunzione utero-tubarica come barriera per impedire la fuoriuscita embrione che si può verificare quando si esegue il trasferimento uterino. Maschi vasectomized sono tenuti ad ottenere destinatari pseudopregnant per il trasferimento di embrioni. Entrambe le tecniche sono discusse.

Trasferimento di Embrione utero-tubarica e vasectomia nel modello murino

Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

MicroSecure Vitrification è stato sviluppato come un sistema di vitrificazione chiuso asettico non commerciale, conforme alle buone pratiche di produzione e manipolazione dei tessuti della FDA. A causa del ritiro dall'industria delle paillettes per embrioni ostruite idrofobiche, la procedura di vitrificazione è stata modificata per includere un sigillo interno prima del tappo di cotone interno standard.

Modificato vetrificazione MicroSecure: Un altamente Procedura Crioconservazione sicuro ed efficace, semplice e per blastocisti umane

Le tecniche di riproduzione assistita (ARTs) sono in continua valutazione per migliorare i risultati e ridurre i rischi associati. Questo manoscritto descrive una procedura di trasferimento dell'embrione minimamente invasiva con un efficiente protocollo di crioconservazione che consente l'uso di conigli come modello animale ideale di riproduzione umana.

Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit

Qui presentiamo un protocollo time-lapse morfometrica per seguire l'intensità della contrazione di blastocisti e re-espansione durante gli interventi di previtrification ed il recupero post-riscaldamento. L'applicazione del protocollo è possibile in vitro fertilizzazione laboratori attrezzati con microscopi time-lapse e raccomanda lo sviluppo di un metodo di vitrificazione blastocisti ottimale.

Morfometrica protocollo per la valutazione obiettiva dei blastocisti comportamento durante la vetrificazione e passaggi scaldavivande

La biopsia e la vitrificazione della blastocisti sono necessarie per condurre in modo efficiente i test genetici preimpianto. Un approccio che prevede l'apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 7-8 cellule di trectodermi nel giorno 5-7 post-inseminazione limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l'esposizione dell'embrione a condizioni ambientali non ottimali.

Biopsia e vetrificazione dell'esplosione umana

Qui, descriviamo un metodo per riscaldare le blastocisti umani vetrificati, maficandoli attraverso il periodo di impianto in vitro, digerindoli in singole cellule e raccogliendo cellule trofoblaste precoci per ulteriori indagini.

Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani

Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per rimuovere prontamente una parte dei complessi cumulo-ovocita dopo il prelievo degli ovuli per accelerare il processo di osservazione della fecondazione in vitro, riducendo il tempo necessario per la rimozione delle cellule della granulosa, riducendo al minimo l'esposizione degli ovociti agli elementi esterni e non ostacolando lo sviluppo dell'embrione, migliorando in definitiva l'efficienza delle procedure di laboratorio della fecondazione in vitro.

La rimozione parziale immediata dei complessi cumuli-ovociti: un approccio raffinato per l'osservazione rapida della fecondazione in vitro

Scopri il protocollo Spatola Montevideo per la vitrificazione di embrioni pre-impianto di topo e pecora. Questo metodo economico utilizza strumenti artigianali e crioprotettori per preservare gli embrioni con alte percentuali di sopravvivenza.

Spatola Montevideo Dispositivo per la vitrificazione di embrioni di mammiferi

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