Isolamento di cellule polmonari contenenti retinoidi mediante smistamento cellulare

La nostra ricerca si concentra sulla comprensione del ruolo fisiologico della vitamina A e dei suoi metaboliti, collettivamente chiamati retinoidi, nel mantenimento della salute funzionale del polmone adulto.

A causa della composizione cellulare altamente specializzata ed eterogenea del polmone, le tecniche a singola cellula come la marcatura, lo smistamento e il sequenziamento di cellule specifiche sono essenziali per studiare la comunicazione cellulare mediata dai retinoidi nella salute e nella malattia polmonare.

La nostra ricerca ha svelato la complessità precedentemente insospettata del metabolismo e della segnalazione dei retinoidi nel polmone adulto e il suo ruolo critico nella protezione del polmone durante le lesioni.

Il nostro protocollo consente l'isolamento di specifiche popolazioni di cellule polmonari basate sull'autofluorescenza endogena dei retinoidi e può essere facilmente integrato con la colorazione anticorpale coniugata con fluorocromo in tutta l'espressione proteica fluorescente.

I nostri studi stanno cambiando il paradigma per comprendere i meccanismi del metabolismo della vitamina A e le sue azioni. I risultati di questi studi possono e avranno un impatto sulle strategie attuali, compresi gli interventi nutrizionali volti ad alleviare le malattie polmonari.

[Presentatore] Per iniziare, eseguire il test di pizzicamento delle dita dei piedi su un topo anestetizzato per verificare il livello di incoscienza. Rimuovere i peli sciolti e lo sporco visibile dal sito chirurgico. Quindi, pulire l'area con alcol al 70% per la disinfezione. Utilizzando strumenti chirurgici sterili, aprire le cavità addominali e toraciche. Taglia le costole e il diaframma per esporre i polmoni e il cuore. Quindi, tagliare la vena cava inferiore. Applicare un tampone assorbente per assorbire il sangue rilasciato. Perfondere i polmoni in situ attraverso il ventricolo destro del cuore con 5 millilitri di HBSS sterile senza calcio e magnesio. Verificare la corretta perfusione osservando il tessuto polmonare che diventa bianco. Perfondere nuovamente i polmoni utilizzando un'altra siringa da 10 millilitri riempita con HBSS sterile contenente enzimi, calcio e magnesio. Ora, rimuovete i polmoni e trasferiteli in una piastra di coltura cellulare contenente 2 millilitri di HBSS sterile con calcio e magnesio. Sotto una cappa laminare, sciacquare i polmoni e tritarli in piccoli pezzi con una lama chirurgica sterile. Aggiungere 5 millilitri di enzima HBSS contenente calcio e magnesio ai polmoni tritati. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per trasferire la sospensione in una provetta da 15 millilitri. Lavare la piastra di coltura cellulare con altri 5 millilitri di enzima contenente HBSS. Trasferire la soluzione di lavaggio nel tubo da 15 millilitri. Incubare il tessuto polmonare tritato nell'enzima contenente HBSS su un agitatore rotante a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Ogni 15 minuti, pipettare il tessuto tritato 10 volte attraverso una pipetta sierologica da 10 millilitri all'interno della cappa laminare per migliorare la dissociazione. Fallo tre volte. Passare la sospensione cellulare risultante attraverso un colino da 100 micrometri in una provetta da 50 millilitri contenente 20 millilitri di soluzione fredda per l'imaging di cellule vive contenente meno del 5% di FBS. Centrifugare le celle a 500 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare. Quando gli eritrociti si sono lisati, aggiungere 20 millilitri di soluzione fredda per l'imaging di cellule vive alla sospensione prima di centrifugare nuovamente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 20 millilitri di soluzione fredda per l'imaging di cellule vive. Passare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in una provetta da 50 millilitri contenente 20 millilitri di soluzione fredda per l'imaging di cellule vive. Centrifugare la sospensione cellulare come prima per raccogliere le cellule. Infine, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di soluzione fredda di imaging di cellule vive. Contare le cellule al microscopio utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione a circa 5-10 milioni di cellule per millilitro. Prelevare un'aliquota della sospensione cellulare preparata e metterla da parte come controllo di iniezione non colorato. Aggiungere citoschermo colorante vitale a una diluizione da 1 a 1000 alla sospensione cellulare rimanente per ottenere una concentrazione finale di 30 nanomolari. Quindi, collegare un filtro a un tubo di raccolta in polistirolo da 5 millilitri. Passare la sospensione attraverso il filtro. Eseguire lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per isolare singole cellule vive contenenti retinoidi in base alla loro emissione a 455 nanometri. Esegui la discriminazione sequenziale del singoletto utilizzando un grafico dell'altezza di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione in avanti. Escludere le cellule morte in base alle caratteristiche di dispersione e alla colorazione del citoscreen. Gate, smistamento e raccolta di singole cellule vive contenenti retinoidi in base alla loro emissione a 455 nanometri dopo eccitazione a 350 nanometri. Infine, eseguire l'analisi dei dati FACS utilizzando il software di citometria a flusso. Una popolazione distinta di singole cellule vive con alta autofluorescenza a 455 nanometri è stata rilevata nei topi wild-type con sospensioni di cellule polmonari. La stessa popolazione autofluorescente era assente nelle sospensioni di cellule polmonari knockout di Lrat. Una sottopopolazione di fibroblasti positivi al tdTomato è stata isolata con successo utilizzando un sistema di marcatura Cre-inducibile, consentendo un'ulteriore separazione delle cellule contenenti retinoidi da questa popolazione cellulare in base all'autofluorescenza. La presenza di fibroblasti polmonari tdTomato positivi è stata confermata mediante microscopia a fluorescenza che mostra cellule marcate in rosso. La presenza di retinoidi nei fibroblasti selezionati è stata convalidata utilizzando l'HPLC, identificando il retinolo e gli esteri del retinolo. Goccioline lipidiche sono state rilevate nei fibroblasti contenenti retinoidi.