Name: Generazione di colture monoclonali da linea cellulare JW18 di Drosophila melanogaster infettata da Wolbachia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Scopri come generare colture monoclonali da linea cellulare JW18 di Drosophila melanogaster infettata da Wolbachia. Questo protocollo a basso costo minimizza lo stress cellulare e migliora la riproducibilità negli studi di simbiosi microbica.

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<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m siringa fliter&nbsp; &nbsp;</td><td>TPP</td><td>99722</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>70011044</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Vetro di copertura rotondo da 12 o 18 mm&nbsp;</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon da 15 mL</td><td>Genoplasto</td><td>601052</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td>Coltura tissutale trattata</td></tr><tr><td>5 &micro; m filtro per siringhe</td><td>Whatman</td><td>10462000</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td>Coltura tissutale trattata</td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7596</td><td>Coltura tissutale trattata</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>J66501.30</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari, 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one</td><td>391-3103</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Raschiatori cellulari&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>391-3010</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Smalto trasparente&nbsp;</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiale CryoPure</td><td>Sarstedt</td><td>72.379</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>DMSO, grado per colture cellulari</td><td>Merck</td><td>D2650-100ML</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>DreamTaq PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>Codice 324503-100GM</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Alimentazione per elettroforesi</td><td>Merck</td><td>PS 251-2</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Concentratore Plus</td><td>Merck</td><td>EP5305000509</td><td>Al suo posto è possibile utilizzare concentratori sottovuoto di qualsiasi marca.</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>1009861000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging EVOS M5000</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>AMF5000</td><td>Il microscopio invertito di qualsiasi marca può essere utilizzato per monitorare la progressione del clone. Per visualizzare i pesci è necessario un microscopio a fluorescenza.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td>Inattivato a caldo</td></tr><tr><td>Formaldeide&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>Codice 047377.9L</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&nbsp;</td><td>Merck</td><td>F7503-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi per elettroforesi su gel</td><td>Mannaia scientifica</td><td>MSMIDI</td><td></td></tr><tr><td>Termocamera per gel</td><td>BioRad</td><td>12009077</td><td>Sistema di imaging GelDoc Go Gel</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Scala del DNA</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>88870005</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica Herasafe 2025 Classe II</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>51033314</td><td>Le cappe di sicurezza biologica di qualsiasi marca possono essere utilizzate purché mantengano un ambiente sterile all'interno.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Soluzione (20 mM) 5 mL</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>62249</td><td>Conservare al buio.</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Merck</td><td>258148-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&nbsp; PIPETBOY acu 2 Aiuto per pipette</td><td>Fisher Scientifico</td><td>NC0085686</td><td>È possibile utilizzare un pipettatore sierologico di qualsiasi marca.</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Merck</td><td>I9516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore da laboratorio</td><td>&nbsp; Liebherr&nbsp;</td><td>LGUex 1500 MediLine</td><td>Qualsiasi congelatore in grado di mantenere una temperatura costante è adatto.</td></tr><tr><td>Serbatoio di azoto liquido</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>CY50985</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Merck</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado molecolare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Nanogoccia</td><td>Peqlab</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro Neubauer</td><td>Merck</td><td>BR717810-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp; M Pellicola sigillante</td><td>Merck</td><td>HS234526B-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice raffreddata a Peltier</td><td>Memmert</td><td>IPP55plus</td><td>Qualche incubatrice in grado di mantenere costante 25? C è adatto. Non è richiesto alcun controllo CO2 per la linea cellulare JW18 o i suoi cloni.</td></tr><tr><td>Fenolo/Cloroformio/Alcool isoamilico (25:24:1)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>327115000</td><td></td></tr><tr><td>Set di pipette</td><td>Eppendorf</td><td>EP2231300008</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Merck</td><td>P1190-500G</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Quasar Sonda 16s rRNA FISH con 670 tag&nbsp; mettere</td><td>Tecnologie di bioricerca</td><td></td><td>Su misura, le sequenze delle sonde possono essere trovate nella Tabella 1.</td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata</td><td>Rete di laboratorio</td><td>C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>rpl32 innesco in avanti 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATC-3'</td><td>Genomica Eurofins</td><td></td><td>Realizzato su misura sulla base del riferimento citato nell'articolo</td></tr><tr><td>rpl32 innesco inverso 5'-CAATCTCCTTGCGCTTCTTG-3'</td><td>Genomica Eurofins</td><td></td><td>Realizzato su misura sulla base del riferimento citato nell'articolo</td></tr><tr><td>SDS</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>AM9823</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche</td><td>Corning</td><td>357771</td><td></td></tr><tr><td>Scudi e Sang M3 Insect Medium</td><td>Merck</td><td>S8398</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Tampone di ibridazione Stellaris RNA FISH&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologie di bioricerca</td><td>SMF-HB1-10</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH Wash Buffer A&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologie di bioricerca</td><td>SMF-WA1-60</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH Wash Buffer B&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologie di bioricerca</td><td>SMF-WB1-20</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Serbatoi di reagenti sterili&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>8094</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>tampone TAE</td><td>Merck</td><td>1061741000</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampone TE&nbsp;</td><td>Merck</td><td>93283</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Syngen Biotech</td><td>Blocco termico 96</td><td>Al suo posto è possibile utilizzare un termociclatore di qualsiasi marca.</td></tr><tr><td>Base tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Congelatore a bassissima temperatura</td><td>Società PHC&nbsp;</td><td>in MDF-DU502VH-PE</td><td>Qualsiasi congelatore da laboratorio in grado di mantenere -80 ? C può essere usato.</td></tr><tr><td>Vectashield Montaggio Medio&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Laboratori Vector</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>innesco wsp avanti 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3'</td><td>Genomica Eurofins</td><td></td><td>Realizzato su misura sulla base del riferimento citato nell'articolo</td></tr><tr><td>innesco wsp inverso 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3'</td><td>Genomica Eurofins</td><td></td><td>Realizzato su misura sulla base del riferimento citato nell'articolo</td></tr></tbody></table>

generazione di colture monoclonali da linea cellulare jw18 di drosophila melanogaster infettata da wolbachia

Generation of Monoclonal Cultures from Wolbachia-infected Drosophila melanogaster JW18 Cell Line

Abbiamo visualizzato il processo di creazione di colture monoclonali con la microscopia ottica dal giorno della preparazione della sospensione e della placcatura a singola cellula (giorno 0) fino alla creazione di linee cellulari continue (giorno 45 o 77, Figura 2). I primi segni di divisione cellulare sono stati osservati il giorno 3 (4 giorni dopo la piastratura, poiché la piastratura è stata eseguita il giorno 0) quando c'erano già quattro cellule per pozzetto (Figura 2). Il giorno 14, i cloni sono cresciuti come un monostrato (JW18-B9, C7 ed E5) o una sfera (JW18-G4), che è stata interrotta durante il passaggio. Il giorno 28, le differenze nella crescita tra le linee cellulari erano più evidenti. La coltura JW18-C7 era confluente il giorno 45, mentre le restanti colture clonali si sono stabilite solo al giorno 77. Abbiamo anche visualizzato le quattro diverse colture 30 passaggi dopo l'insediamento per catturare le differenze nelle morfologie cellulari (Figura 3).
Per determinare lo stato di infezione da Wolbachia delle colture monoclonali, abbiamo condotto PCR (Figura 4) e FISH (Figura 5). Abbiamo osservato che tutti i cloni tranne uno (JW18-C7) hanno prodotto una banda per il gene wsp , indicativo di un'infezione da Wolbachia . La FISH ha confermato i risultati della PCR: i cloni JW18-B9, JW18-E5 e JW18-G4 hanno mantenuto l'infezione da Wolbachia , mentre il clone JW18-C7 non aveva Wolbachia. Complessivamente, da una popolazione di cellule miste di JW18, siamo stati in grado di stabilire quattro colture clonali, tre delle quali hanno mantenuto l'infezione originale di Wolbachia . I dati grezzi sono accessibili all'indirizzo Figshare: https://figshare.com/s/15fde47ca7338f31dda9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig1.jpg"> 
Figura 1: Flusso di lavoro per la generazione di colture monoclonali. (A) Diluizioni primarie e secondarie nella piastra a 96 pozzetti. (B) Singole celle dopo la diluizione seriale. (C-E) Progressione nella moltiplicazione delle cellule e trasferimento da piastra a 96 pozzetti a piastra a 24 e 6 pozzetti, rispettivamente. (F) Colture continue in matracci per colture cellulari da 25 cm2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig2.jpg"> 
Figura 2: Progressione delle linee clonali JW18 da coltura a cellula singola a coltura multicellulare. Immagini in campo chiaro di linee clonali dal giorno 0 (giorno della piastratura) al giorno 77, quando tutte le linee sono state stabilite con successo in un pallone di coltura cellulare da 25 cm2 . Barre della scala = 25 μm (giorno 0), 50 μm (giorno 3), 150 μm (giorno 14), 300 μm (giorni 28, 45, 77). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig3.jpg"> 
Figura 3: Morfologia delle singole linee clonali JW18. Immagini in campo chiaro di linee clonali che mostrano morfologie cellulari al passaggio 30 dopo l'insediamento. Barre di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig4.jpg"> 
Figura 4: Stato di Wolbachia delle colture clonali esaminate mediante PCR. PCR per Wolbachia nella linea cellulare parentale JW18 e nelle linee clonali JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5 e JW18-G4 al passaggio 11 dopo l'istituzione. La banda di Wolbachiawsp conferma la presenza di Wolbachia, mentre la banda di Drosophilarpl32 è una PCR per il controllo di qualità del DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig5.jpg"> 
Figura 5: Stato di Wolbachia delle colture clonali esaminate da FISH. Linea cellulare parentale JW18 e cloni JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5, JW18-G4 visualizzati mediante colorazione FISH al passaggio 13 dopo l'insediamento. Wolbachia è colorato con la sonda 16s rRNA Stellaris FISH marcata con Quasar 670 impostata in magenta e gli acidi nucleici sono colorati con Hoechst 33342 in ciano. Barre di scala = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella supplementare S1: Sonde oligonucleotidiche progettate contro l'rDNA di Wolbachia wMel 16S e loro confronto con le sonde pubblicate da Schneider et al.42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/Table%20S1.%20Stellaris%20probe%20set%20_16052025.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

Generazione di colture monoclonali da linea cellulare JW18 di Drosophila melanogaster infettata da Wolbachia

Cell lines are widely used models in biological research. They are particularly useful in studies of intracellular bacteria that cannot be efficiently ...

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