Modifica enzimatica e citometria a flusso: valutazione delle proteine visualizzate sulla superficie del lievito

Questa ricerca si concentra sullo studio delle modifiche chimiche alle proteine che determinano il comportamento delle cellule. In questo caso, l'obiettivo è comprendere le preferenze e la cinetica degli enzimi che modificano una varietà di substrati.

La capacità di defosforilare una molecola di substrato visualizzata sulla superficie del lievito è stata dimostrata per la prima volta. Questa scoperta apre possibilità per la mappatura cinetica generalizzabile di modifiche enzimatiche che in precedenza non erano accessibili. Questa ricerca affronta le sfide associate alla comprensione delle interazioni tra i substrati enzimatici. In genere, per questo tipo di valutazione sono necessari lisati cellulari o peptidi personalizzati. In questo caso, viene fornita un'alternativa a FasL attraverso l'uso di substrati visualizzati con lievito.

Questo protocollo fa avanzare la tradizionale visualizzazione della superficie del lievito verso l'analisi di quelle che normalmente sarebbero reazioni enzimatiche intracellulari nello spazio extracellulare, consentendo l'analisi FasL di queste interazioni normalmente difficili da valutare.

Questo protocollo consente di interrogare le preferenze del substrato di una varietà di enzimi attraverso metodi ad alto rendimento e di eseguire studi cinetici con una semplice lettura.

[Istruttore] Per iniziare, scongelare un'aliquota delle cellule di lievito preparate con ghiaccio. Aggiungere da 0,5 a 1,5 microgrammi di DNA plasmidico contenente il costrutto di visualizzazione del lievito direttamente alle cellule. Quindi aggiungere 0,5 millilitri della soluzione di trasformazione o una soluzione sterile di polietilenglicole al 50% e acetato di litio 0,1 molare. Combinare accuratamente la miscela di cellule, DNA plasmidico e soluzione di trasformazione mediante pipettaggio. Incubare staticamente la miscela di trasformazione per 30-60 minuti a 30 gradi Celsius e agitare la miscela a intervalli di 15 minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1000G. Preparare una provetta di coltura da 14 millilitri con 4,5 millilitri di terreno di crescita cellulare di lievito contenente plasmidi, o SDCAA. Risospendere le cellule contenenti il plasmide desiderato in 500 microlitri di SDCAA e inoculare i 4,5 millilitri di terreno preparati. Distribuire con cura 50 microlitri dei cinque millilitri di coltura inoculata su una piastra SDCAA senza forare la coclea. Incubare staticamente a 30 gradi Celsius per 48 ore per determinare l'efficienza della trasformazione. Ora, incubare i cinque millilitri di coltura cellulare SDCAA in un incubatore agitato a 30 gradi Celsius e 300 giri/min per almeno 18 ore. Monitora la densità ottica a 600 nanometri dopo 16 ore e ripeti di nuovo dopo 20 ore. Una volta che il campione raggiunge una densità ottica non superiore a sei, centrifugare la coltura per tre minuti a 2500 g e scartare il surnatante senza disturbare il pellet di lievito. Risospendere il pellet di lievito nell'induzione dell'espressione proteica, o mezzi SRGCAA, a una densità ottica finale a 600 nanometri meno di uno. Incubare la coltura del lievito in un'incubatrice vibrante a 30 gradi Celsius e 300 giri/min per almeno otto ore, ma non più di 24 ore. Quindi misurare la densità ottica a 600 nanometri per determinare la densità cellulare. Preparare il tampone di lavoro per i campioni diluendo la soluzione tampone di lavoro 2X in un rapporto uno a due con acqua deionizzata in una fiala da 1,7 millilitri. Aggiungere il volume appropriato di coltura di lievito necessario per recuperare due milioni di cellule di lievito nella fiala da 1,7 millilitri per ogni campione. Centrifugare la fiala per un minuto a 4500 g e, utilizzando una micropipetta, rimuovere con cura ed eliminare il surnatante come rifiuto a rischio biologico. Risospendere le celle pellettate in un millilitro di PBSA prima di ripetere la centrifugazione e la rimozione del surnatante. Tenetelo da parte. Preparare la soluzione umana ricombinante di SHP-2 a una concentrazione finale di 1.000 nanomoli in un volume totale di reazione di 20 microlitri. Quindi, aggiungi 7,7 milligrammi di DTT in 10 millilitri di acqua deionizzata in un tubo conico da 15 millilitri per creare una soluzione DTT da cinque millimolari. Ora, prendere le celle pellettate e risospenderle nel tampone di lavoro in modo che il volume di reazione finale sia di 20 microlitri per campione. Aggiungere due microlitri della soluzione DTT da cinque millimolari a ciascun campione per una concentrazione finale di DTT di 0,5 millimolari. Aggiungere il volume preparato di SHP-2 a ciascun campione per ottenere un volume finale di 20 microlitri e mescolare delicatamente con una micropipetta. Avvolgere i coperchi delle fiale dei campioni con Parafilm per evitare perdite o contaminazioni incrociate. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per due ore su un rotore a velocità costante. Dopo aver rimosso i campioni dal rotore, arrestare la reazione aggiungendo un millilitro di PBSA a ciascun campione prima di centrifugarli nuovamente per un minuto. Quindi scartare il surnatante. Risospendere i campioni pellettati in una miscela da 20 microlitri dei reagenti primari corrispondenti e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, centrifugare i campioni a 4500 G per un minuto e scartare il surnatante come rifiuto a rischio biologico. Lavare le cellule una volta rimettendole in sospensione in un millilitro di PBSA prima di centrifugare nuovamente le cellule. Ora, risospendere i campioni in una miscela da 20 microlitri dei reagenti secondari corrispondenti e incubare per 15 minuti al buio. Dopo aver centrifugato i campioni e scartato il surnatante, lavare nuovamente le cellule con PBSA prima di centrifugarle nuovamente. Successivamente, risospendere i campioni lavati in 300-500 microlitri di PBSA e trasferirli in provette di polistirene da cinque millilitri per l'analisi della citometria a flusso. Dopo aver preparato il citometro, fare clic su File, seguito dal pulsante Nuovo esperimento, assegnare un nome all'esperimento e fare clic su Salva per assicurarsi che i dati acquisiti vengano salvati nel percorso del file desiderato. Selezionare l'icona del grafico a punti nella barra degli strumenti superiore per creare due o più grafici a punti per ciascun campione. Per uno dei dot plot, assicurarsi che il nome dell'asse x visualizzi il canale FSCA e il nome dell'asse y visualizzi il canale SSCA. Per un altro grafico, selezionare il nome dell'asse x per visualizzare il canale in cui il reagente secondario che ha come bersaglio l'anticorpo primario anti-epitopo diventa fluorescente e il nome dell'asse y per visualizzare il canale in cui il reagente secondario della streptavidina diventa fluorescente. Fornire un nome descrittivo per il campione facendo clic con il pulsante destro del mouse sul tubo, selezionando Modifica nome e inserendo il nome del campione. Posizionare ciascuna provetta del campione nel supporto del citometro e fare clic su Esegui per iniziare a caricare il campione e acquisire i dati. Regolare gli eventi, il tempo e la portata secondo necessità. Definire un cancello che circonda le cellule di lievito sane nel grafico SSCA rispetto a FSCA. Quindi registrare la fluorescenza di tutti i campioni di controllo. Definire una strategia di gating per il grafico creato prima di analizzare i campioni trattati. Registrare la fluorescenza dei campioni defosforilati utilizzando il citometro e la strategia di gating prima di analizzare i dati utilizzando il software di citometria a flusso. Valutare la fosforilazione misurando e confrontando la mediana dell'asse y delle cellule che esprimono proteine sulla loro superficie e la fosforilazione di base fornita dalle cellule non riproduttive tra campioni e controlli. Infine, calcola la differenza percentuale di fosforilazione mediana utilizzando la formula fornita. In questa figura è illustrato l'effetto della variazione delle concentrazioni di fosfatasi SHP-2 e dei tempi di incubazione sulla differenza mediana di fosforilazione nei substrati esposti sulla superficie del lievito. La differenza percentuale mediana di fosforilazione è diminuita nel tempo in tutte le concentrazioni di SHP-2, con la più alta defosforilazione osservata a una concentrazione di SHP-2 di 1.000 nanomolari a quattro ore. Dopo due ore di incubazione, 1.000 nanomolari SHP-2 hanno determinato una differenza di fosforilazione mediana di circa il 48,8%, significativamente inferiore alla condizione di 750 nanomolari nello stesso punto temporale. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella differenza mediana di fosforilazione quando l'incubazione è stata estesa da due ore a tre ore su concentrazioni di SHP-2 a 500 nanomolari, 750 nanomolari e 1.000 nanomolari.