Name: Modifica enzimatica e citometria a flusso: valutazione delle proteine visualizzate sulla superficie del lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Scopri la modifica enzimatica e la citometria a flusso per valutare le proteine visualizzate sulla superficie del lievito. Questo metodo consente di studiare la defosforilazione da parte della tirosina fosfatasi SHP-2.

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1. Crescita cellulare di plasmidi di lievito e induzione dell'espressione proteica
<ol>
	<li>Seguendo la ricetta descritta nella Tabella 1, preparare i terreni necessari per la crescita di lieviti non contenenti plasmidi (YPD), la crescita di cellule di lievito contenenti plasmidi (SD-CAA) e l'induzione dell'espressione proteica (SRG-CAA), nonché le piastre SD-CAA.</li>
	<li>Trasformare il DNA plasmidico del lievito contenente la coppia chinasi-substrato in cellule di lievito EBY-100 attraverso il metodo30,31 basato sui cationi di litio, comunemente adottato per l'uso nei kit di trasformazione del lievito di una varietà di produttori. NOTA: L'elettroporazione32 o altre tecniche di trasformazione plasmidico di lievito preferite possono essere utilizzate a seconda del costrutto plasmidico da trasformare.</li>
	<li>Preparare una provetta di coltura da 14 mL con 10 mL di terreno YPD. Inoculare le cellule EBY-100 e farle crescere in un incubatore agitatore a 30 °C, 300 giri/min fino a quando la coltura raggiunge una densità ottica (OD600 nm) di 0,8-1,0 (8 x 106- 1 x 107 cellule/mL). NOTA: Il diametro esternodi 600 nm viene misurato preparando cuvette per campioni da 3 mL contenenti diluizioni 1:10 di colture di lievito nei rispettivi terreni e cuvette bianche da 3 mL contenenti i terreni utilizzati per le diluizioni dei campioni. Il programma OD600nm sullo spettrofotometro viene utilizzato per misurare prima la cuvetta bianca, quindi ogni cuvetta campione impostando la diluizione corrispondente preparata per ciascun campione. 1 OD600nm corrisponde a 1 × 107 lievito/mL.</li>
	<li>Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 1.000 x g per 3 minuti e lavare con la1a soluzione di lavaggio fornita nel kit di trasformazione del lievito, o TE (10 mM Tris-HCl e 1,0 mM EDTA)31.</li>
	<li>Pellettare nuovamente le cellule a 1.000 x g per 3 minuti e risospendere in 1 mL del tampone di trasformazione fornito nel kit di trasformazione del lievito o in acqua sterile. Le celle devono essere aliquotate in aliquote da 50 μL e possono essere conservate a -80 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
	<li>Per la trasformazione plasmidica, viene preparata un'aliquota per plasmide e scongelata con ghiaccio, quindi 0,5-1,5 μg di DNA plasmidico contenente il costrutto di visualizzazione del lievito vengono aggiunti direttamente alle cellule. Vengono aggiunti 0,5 mL della soluzione di trasformazione fornita nel kit di trasformazione del lievito, o 0,5 mL di una soluzione sterile di polietilenglicole al 50% e 0,1 M di LiOAc31. Combinare accuratamente la miscela di cellule, DNA plasmidico e soluzione di trasformazione mediante pipettaggio.</li>
	<li>Incubare staticamente la miscela di trasformazione per 30-60 minuti a 30 °C, la miscela a vortice a intervalli di 15 minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.000 × g per 3 min.</li>
	<li>Preparare una provetta per coltura da 14 mL con 4,5 mL di terreno SD-CAA. Risospendere le cellule contenenti il plasmide desiderato in 500 μL di SD-CAA e inoculare i 4,5 mL preparati.</li>
	<li>Facendo attenzione a non perforare l'agar, distribuire 50 μL dei 5 mL di coltura inoculata su una piastra SD-CAA e incubare staticamente a 30 °C per 48 ore per determinare l'efficienza di trasformazione.</li>
	<li>Incubare i 5 mL di coltura cellulare SD-CAA in un incubatore con agitazione a 30 °C, 300 giri/min per almeno 18 ore. Monitorare la densità ottica (OD600nm) dopo 16 ore e 20 ore. Una volta che il campione ha raggiunto una densità ottica sufficiente non superiore a 6, centrifugare la coltura per 3 minuti a 2.500 × g. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet di lievito.</li>
	<li>Risospendere il pellet di lievito in SRG-CAA a un OD finale di600 nm inferiore a 1 (&lt;1 × 107 lievito/mL).</li>
	<li>Incubare la coltura di lievito in un'incubatrice con agitazione a 30 °C, 300 giri/min per almeno 8 ore ma non più di 24 ore. NOTA: L'induzione dell'espressione proteica nelle cellule di lievito può essere variata da 20 a 37 °C. 30 °C è adatto per la sintesi di coppie chinasi/substrato29,33, ma può essere regolato se ritenuto necessario per le proteine specifiche in studio.</li>
	<li>Misura OD600nm per determinare la densità cellulare. NOTA: A questo punto il protocollo può essere interrotto conservando le colture di lievito a 4 °C.</li>
</ol>
2. Biotinilazione dell'anticorpo anti-fosfotirosina 4G10
<ol>
	<li>Risospendere un flaconcino da 2 mg di PEG4-NHS-Biotina a una concentrazione finale di 5 mM aggiungendo 680 μL di PBS sterile. NOTA: La risospensione di PEG4-NHS-Biotina deve essere eseguita di fresco immediatamente prima che venga eseguita la reazione di biotinilazione. NHS si idrolizza in soluzione acquosa. L'uso di PBS e fiale sterili è importante per la preparazione di reagenti per la conservazione a lungo termine e per l'uso in saggi basati su cellule per mitigare eventuali effetti potenziali dei contaminanti sulla vitalità dei reagenti o sui saggi sensibili eseguiti.</li>
	<li>In base alla concentrazione di anticorpi 4G10, aggiungere 100 μg di anticorpo in un flaconcino sterile da 1,7 ml.</li>
	<li>Aggiungere 1 μl dei 5 mM PEG4-NHS-Biotina preparati dal passaggio 2.1 alla fiala contenente i 100 μg di anticorpo 4G10 per ottenere un rapporto molare tra biotina e anticorpo di 7,5:1. Pipettare delicatamente la miscela per omogeneizzare la reazione.</li>
	<li>Incubare la reazione a temperatura ambiente con rotazione costante per almeno 2 ore.</li>
	<li>Seguire il protocollo del produttore per le colonne di desalinizzazione centrifughe da 0,5 mL per sostituire il tampone dal 4G10 biotinilato (B-4G10) al PBS. NOTA: Le colonne di desalinizzazione con un cutoff del peso molecolare (MWCO) di 7 kDa sono comunemente utilizzate per la biotinilazione degli anticorpi per consentire la rimozione della biotina non reagita e di altre piccole molecole mantenendo l'anticorpo più grande.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo B-4G10 a una concentrazione finale di 1 μM in PBSA (PBS con 1 g/L di albumina sierica bovina). Aliquotare l'anticorpo B-4G10 in volumi più piccoli per evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento. NOTA: Gli anticorpi biotinilati possono essere conservati a 4 °C per l'uso quotidiano fino a 3 mesi senza perdere una significativa efficienza. Conservare il resto delle aliquote non utilizzate a -20 °C per un massimo di 2 anni.</li>
</ol>
3. Defosforilazione dei substrati espressi sulla superficie cellulare del lievito
<ol>
	<li>Preparare la soluzione tampone di lavoro 2x come descritto in precedenza in letteratura34. NOTA: Si consiglia 2x per facilitare la misurazione degli ingredienti necessari.</li>
	<li>Preparare il tampone di lavoro per i campioni in una fiala da 1,7 mL diluendo la soluzione tampone 2x preparata al punto 3.1 1:2 in acqua deionizzata. NOTA: Il volume totale di reazione per ciascun campione sarà di 20 μl e ogni campione richiederà tra 10 μl e 18 μl di tampone di lavoro. Preparare una quantità sufficiente di tampone di lavoro per tutti i campioni o i controlli.</li>
	<li>Seguendo la preparazione del campione raccomandata descritta nella Tabella 2, etichettare i flaconcini da 1,7 ml con il nome del controllo o del campione corrispondente.</li>
	<li>Sulla base dell'OD600nm misurato nella fase 1.9, calcolare il volume di coltura necessario per recuperare due milioni (2 × 106) di cellule di lievito dalla coltura di lievito corrispondente per ciascun campione.</li>
	<li>Aggiungere il volume di coltura di lievito calcolato nel passaggio precedente nella fiala da 1,7 ml per ciascun campione.</li>
	<li>Centrifugare il flaconcino per 1 minuto a 4.500 × g. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una micropipetta e gettarlo come rifiuto a rischio biologico.</li>
	<li>Risospendere le cellule pellettate in 1 mL di PBSA e ripetere il passaggio 3.6. NOTA: È importante rimuovere la maggior quantità possibile di surnatante senza disturbare le celle pellettate.</li>
	<li>Sulla base della sua concentrazione di riserva, calcolare il volume di SHP-2 umano ricombinante necessario per avere una concentrazione finale di 1.000 nM in un volume totale di reazione di 20 μL. NOTA: L'SHP-2 ricombinante deve essere aliquotato in piccoli volumi in modo che qualsiasi proteina utilizzata in ciascun test non sia passata attraverso più di due cicli di congelamento-scongelamento. L'eventuale residuo di SHP-2 da un'aliquota dopo che tutti i campioni sono stati preparati per un saggio deve essere scartato. Le concentrazioni di stock degli enzimi ricombinanti possono variare a seconda del numero di lotto. L'SHP-2 ricombinante è comunemente formulato a una concentrazione standard di 0,2-0,4 mg/mL. Per una concentrazione stock di 0,324 mg/mL di SHP-2, ciò corrisponde a una concentrazione stock di 4,696 μM (SHP-2 ha un peso molecolare di 69 kDa). 4,26 μL di SHP-2 in una reazione da 20 μL producono una concentrazione finale di reazione di 1.000 nM SHP-2.</li>
	<li>Aggiungere 7,7 mg di DTT in 10 mL di acqua deionizzata preparata in un conico da 15 mL per creare una soluzione DTT da 5 mM. Se le limitazioni dell'apparecchiatura rendono difficile pesare i milligrammi, aggiungere 0,77 g di DTT a 10 mL di acqua deionizzata, quindi eseguire una diluizione 100x per creare la soluzione DTT da 5 mM utilizzata per il saggio. NOTA: La soluzione DTT può essere preparata in soluzioni madre a concentrazione più elevata da diluire a 5 mM se non è possibile misurare quantità su scala millimetrica utilizzando l'attrezzatura disponibile. La soluzione di DTT deve essere preparata fresca prima della risospensione cellulare in tampone di lavoro a causa della sua tendenza all'idrolisi, che la rende instabile per lunghi periodi quando diluita in acqua.</li>
	<li>Risospendere le cellule pellettate nel tampone di lavoro preparato al punto 3.2 in modo che il volume di reazione finale in ciascun campione o controllo sia di 20 μl. NOTA: La quantità di tampone di lavoro aggiunta deve essere calcolata in base alla quantità di DTT (2 μL) e SHP-2 (calcolata al punto 3.8) che sarà presente in ciascun campione.</li>
	<li>Aggiungere 2 μl della soluzione DTT da 5 mM preparata al punto 3.9 a ciascun campione o controllo per ottenere una concentrazione finale di reazione di 0,5 mM DTT.</li>
	<li>Aggiungere il volume di SHP-2 calcolato al punto 3.8 a ciascun campione per ottenere un volume finale di 20 μl e mescolare delicatamente con una micropipetta.</li>
	<li>Avvolgere i coperchi delle fiale dei campioni in parafilm per evitare perdite o contaminazioni incrociate.</li>
	<li>Incubare i campioni a 37 °C per 2 ore su un rotore a velocità costante.</li>
	<li>Rimuovere i campioni dal rotore e arrestare la reazione aggiungendo 1 mL di PBSA a ciascun campione.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.6.</li>
</ol>
4. Marcatura cellulare e analisi in citometria a flusso di substrati defosforilati
<ol>
	<li>Risospendere i campioni del passaggio 3.16 in una miscela da 20 μl dei reagenti primari corrispondenti, come descritto nella Tabella 2. Incubare i campioni per 20 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Tutte le concentrazioni di reagenti utilizzate sono state calcolate in eccesso rispetto al numero di proteine espresse sulla superficie delle cellule di lievito. Il calcolo presuppone l'espressione di 10.000 proteine/cellula da tutti i 2 x 106 lieviti in un campione35, quando di routine solo ~50% di essi lo fa. La Tabella 3 mostra l'eccesso di rapporto dei reagenti di marcatura per ciascuno dei reagenti espresso nella Tabella 2, calcolato come segue: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq1v3.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Centrifugare i campioni a 4.500 × g per 1 minuto e scartare il surnatante come rifiuto a rischio biologico.</li>
	<li>Lavare le cellule una volta risospendendole in 1 mL di PBSA. Ripetere il passaggio 4.2.</li>
	<li>Risospendere i campioni in una miscela da 20 μl dei reagenti secondari corrispondenti, come descritto nella tabella 2. Incubare i campioni per 15 minuti in assenza di luce.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.2.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.3.</li>
	<li>Risospendere i campioni lavati in 300-500 μL di PBSA e trasferirli in provette di polistirene da 5 mL per analizzarli immediatamente utilizzando un citometro a flusso appropriato. NOTA: Se è necessario trasportare campioni, tenerli su ghiaccio umido. Non è consigliato, ma i campioni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 2 ore come pellet umido.</li>
	<li>Dopo aver eseguito l'avvio e la preparazione necessari del citometro per un nuovo esperimento, fare clic sul pulsante Nuovo esperimento nel menu File , assegnare un nome all'esperimento e fare clic su Salva per assicurarsi che i dati acquisiti vengano salvati nel percorso del file desiderato.</li>
	<li>Selezionare l'icona del grafico a punti nella barra degli strumenti superiore per creare due o più grafici a punti per ogni campione da eseguire. Per uno dei dot-plot, selezionare il nome dell'asse X per visualizzare il canale FSC-A e il nome dell'asse Y per visualizzare il canale SSC-A. Questo grafico mostra l'area Side Scatter rispetto all'area Forward Scatter e viene utilizzato per bloccare le cellule di lievito per ulteriori analisi.</li>
	<li>Su un altro dot-plot, selezionare il nome dell'asse X per visualizzare il canale in cui il reagente secondario che ha come bersaglio l'anticorpo primario anti-epitopo tag è fluorescente. Selezionare il nome dell'asse Y per visualizzare il canale in cui il reagente secondario della streptavidina diventa fluorescente. Questo grafico mostrerà solo gli eventi controllati dal lato rispetto al grafico di dispersione in avanti come cellule di lievito e viene utilizzato per visualizzare la fosforilazione della tirosina sull'asse Y e l'espressione della superficie del substrato sull'asse X. NOTA: In questo esempio, il reagente secondario che ha come bersaglio l'anticorpo primario anti-epitopo è fluorescente nel canale FITC (AF-488) e il reagente secondario streptavidina è fluorescente nel canale AF-647. I canali utilizzati possono variare a seconda dei reagenti primari e secondari utilizzati durante l'etichettatura.</li>
	<li>Posizionare ciascuna provetta del campione nel supporto della provetta del citometro e selezionare Esegui per il citometro per iniziare a caricare il campione e acquisire i dati. Regolare gli eventi da visualizzare, gli eventi da registrare, il tempo di registrazione e la portata del campione, se necessario.</li>
	<li>Definisci un cancello che circonda le cellule di lievito sane nel grafico SSC-A vs FSC-A creato nel passaggio 4.9. La Figura 1 illustra una rappresentazione descrittiva della strategia di gating da applicare. NOTA: Sul grafico SSC-A rispetto a FSC-A, 100.000 eventi da visualizzare e 50.000 eventi da registrare all'interno del cancello di lievito definito sono una buona linea guida per visualizzare e raccogliere dati sufficienti per ulteriori analisi. Strategie di gating più rigorose per selezionare il lievito singoletto possono essere applicate sulla base di un grafico dell'altezza di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione in avanti, come recentemente riportato36. La strategia di gating mostrata nella Figura 1 corrisponde a un approccio meno rigoroso, che include singoletto e alcuni lieviti doppietti attraverso il gating a dispersione.</li>
	<li>Registrare la fluorescenza di tutti i campioni di controllo utilizzando un analizzatore di citometria a flusso. I campioni di controllo vengono raccolti regolarmente per primi per aiutare a definire una strategia di gating, come descritto di seguito nel passaggio 4.14.</li>
	<li>Definire una strategia di gating per il grafico creato nel passaggio 4.10 prima di analizzare i campioni trattati. La Figura 1 illustra una rappresentazione descrittiva della strategia di gating da applicare.</li>
	<li>Registrare la fluorescenza dei campioni defosforilati utilizzando il citometro a flusso e la strategia di gating definita nei passaggi 4.12 e 4.14.</li>
	<li>Analizza i dati di citometria a flusso acquisiti utilizzando un software di analisi della citometria a flusso.</li>
	<li>Valutare la defosforilazione misurando e confrontando la mediana dell'asse Y delle cellule che esprimono proteine sulla loro superficie e la fosforilazione di base fornita dalle cellule non visualizzanti tra campioni e controlli. Calcolare la differenza di fosforilazione mediana percentuale come segue: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq2v5.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

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<li>Lim, S., Glasgow, J. E., Filsinger Interrante, M., Storm, E. M., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+display+of+proteins+on+the+yeast+cell+surface+simplifies+quantification+of+binding+interactions+and+enzymatic+bioconjugation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Dual display of proteins on the yeast cell surface simplifies quantification of binding interactions and enzymatic bioconjugation reactions.</a> Biotechnol J. 12 (5), (2017).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+TEV+protease+variants+by+yeast+ER+sequestration+screening+%28YESS%29+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endoplasmic+reticulum+sequestration+screening+for+the+engineering+of+proteases+from+libraries+expressed+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast.</a> Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).</li>
<li>Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERD2%2C+a+yeast+gene+required+for+the+receptor-mediated+retrieval+of+luminal+ER+proteins+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway.</a> Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).</li>
<li>Mei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+aromatic+residue-controlled+protein+retention+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of aromatic residue-controlled protein retention in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 292 (50), 20707-20719 (2017).</li>
<li>Ezagui, J., Russell, B., Mairena, Y., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+sequestration+empowers+phosphorylation+profiling+on+the+yeast+surface%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum sequestration empowers phosphorylation profiling on the yeast surface.</a> AIChE J. 68 (12), e17931(2022).</li>
<li>Kawai, S., Murata, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKawai%2C+S+%22Genetic+Transformation+Systems+in+Fungi%22">Genetic Transformation Systems in Fungi</a>. van den Berg, M. A., Maruthachalam, K. 1, Springer International Publishing. 187-192 (2015).</li>
<li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi%3A+methods+and+possible+underlying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li>
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<li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+single-cell+gates+for+yeast+display+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Design+Sel%22%5BJournal%5D)">Optimized single-cell gates for yeast display screening.</a> Protein Eng Design Sel. 38, gzae018(2025).</li>
<li>Margittai, É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+H2O2+in+the+endoplasmic+reticulum+promotes+in+vivo+disulfide+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Production of H2O2 in the endoplasmic reticulum promotes in vivo disulfide bond formation.</a> Antioxid Redox Signal. 16 (10), 1088-1099 (2012).</li>
<li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol Rev. 57 (2), 383-401 (1993).</li>
<li>Ezagui, J., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+screening+on+the+yeast+surface+by+magnetic+bead+selection+and+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation screening on the yeast surface by magnetic bead selection and FACS.</a> Methods Mol Biol. 2681, 275-290 (2023).</li>
<li>Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+SHP2+and+SHP1+protein+tyrosine+phosphatase+domains+by+a+non-conserved+%E2%80%9Cbackdoor%E2%80%9D+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine.</a> Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).</li>
<li>Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+tyrosine+kinase+signalling%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye.</a> J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).</li>
<li>Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titratable+avidity+reduction+enhances+affinity+discrimination+in+mammalian+cellular+selections+of+yeast-displayed+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands.</a> ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).</li>
<li>Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+residue+specificities+of+epigenome+enzymes+by+yeast+surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display.</a> Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Bottiglie da 1 l</td><td>Corning</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1,7/2,0 mL Microprovette</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro; L Punte per pipette SureOne</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-438</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Punte per pipette SureOne</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-408</td><td></td></tr><tr><td>Provette a fondo tondo in polistirene da 12 mL</td><td>Greiner</td><td>07-000-212</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette in plastica da 3 mL</td><td>MARCA</td><td>759076D</td><td></td></tr><tr><td>300 &; L Punte per pipette SureOne</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Caseina acida (acidi Casaimino)</td>Bilancia analitica <td>Fisher Scientific</td><td>BP-1424-500</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>30243397</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri batteriologica&nbsp;</td><td>Cabine di biosicurezza Corning</td><td>Falcon 351008</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biospettrometro Labconco</td><td>Logic Classe II, tipo A2&nbsp; 302310102</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Kinetic 6136000010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Fisher Bioreagenti</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>Citometria a flusso CytoFLEX Analizzatore&nbsp;</td><td>Beckam Coulter</td><td>Cytoflex C09745</td><td>CytExpert software</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Fisher bioreagenti</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-capra FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A16000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>H56165.30</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Link PEG4-NHS-Biotina</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39259</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trasformazione del lievito Frozen EZ II&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td></td></tr><tr><td>Galattosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero per uso generico</td><td>Marvel Scientific</td><td>MS24RAS4RW</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-myc tag di capra&nbsp;</td><td>Centrifuga a mictrotubo Bethyl</td><td>A190-104A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5425 R 5406000313</td><td></td></tr><tr><td>Mini incubatrice refrigerata a bassa temperatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2632</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fosfotirosina di topo 4G10</td><td>BioXcell</td><td>BE0194</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>M PM999</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>Fisher bioreagenti</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Controller&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>easypet 3 4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Raffinosio</td><td>Thermo Scientific</td><td>J21060-36</td><td></td></tr><tr><td>Proteina attiva SHP-2 umana ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>1894-SH</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae lievito ceppo di visualizzazione della superficie EBY 100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per agitatore</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0002 New Brunswick Innova 42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Set di pipette a canale singolo&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio diidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio eptaidrato bibasico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico monoidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia a caricamento dall'alto</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris cloridrato</td><td>EMD Millipore</td><td>648317-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore per revolver a tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-341</td><td></td></tr><tr><td>Carta per pesare&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr><tr><td>Lievito a base di azoto</td><td>BD Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Colonne di desalinizzazione&nbsp;</td><td>Termo Scientifico</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

modifica enzimatica e citometria a flusso: valutazione delle proteine visualizzate sulla superficie del lievito

Enzymatic Modification and Flow Cytometry Assessment of Yeast Surface Displayed Proteins

L'analisi della citometria a flusso da una replica individuale del nostro sistema modello incubato per 2 ore senza (Figura 1A) e con (Figura 1B) 1.000 nM SHP-2 rivela una differenza di fosforilazione mediana del 63,6%, che è definita come il rapporto tra la mediana dell'asse Y (fosforilazione) di tutti gli eventi visualizzati sulla superficie meno il segnale di fosforilazione basale definito come la mediana dell'asse Y degli eventi non visualizzati tra il campio...

Modifica enzimatica e citometria a flusso: valutazione delle proteine visualizzate sulla superficie del lievito

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Due metodi complementari basati sulla citometria di flusso e microscopia sono presentati che consentono la quantificazione, a livello di singola cellula, delle dinamiche di espressione genica indotte dall'attivazione di una via MAPK in lievito.

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Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

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Qui, presentiamo un protocollo per quantificare la sopravvivenza post-stress in campioni di lievito. Il test utilizza due coloranti fluorescenti, SYTO 9 e ioduro di propidio (PI), per quantificare l'integrità della membrana plasmatica. Utilizza la citometria a flusso per fornire stime quantitative e riproducibili delle frazioni cellulari vive, morte e danneggiate per campioni di stress post-ossidativo.

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