Preparazione del tessuto intatto per l'analisi microscopica dello strato cellulare dell'endosperma nei semi di Arabidopsis in via di sviluppo e maturi

Uno dei nostri ambiti di ricerca è la scienza delle sementi. Il nostro obiettivo è rispondere alla domanda su come l'endosperma contribuisca alla germinazione dei semi. Un saggio in vitro chiamato saggio di inibizione della crescita dei semi ha rivelato l'importanza fisiologica dell'endosperma nella germinazione dei semi. I semi di Arabidopsis sono piuttosto piccoli e la posizione dello strato cellulare dell'endosperma è sotto la testa, che sono le cellule. È difficile preparare campioni di endosperma senza fissarli chimicamente. Le precedenti analisi dell'endosperma hanno utilizzato campioni fissati chimicamente, quindi non sono stati in grado di osservare il movimento delle proteine dell'organismo. Il nostro protocollo consente l'imaging a cinque cellule della dinamica delle cellule endospermatiche. Il nostro protocollo può essere eseguito utilizzando apparecchiature di laboratorio standard e consente una comprensione più approfondita degli eventi intercellulari e dei meccanismi molecolari e della regolare funzione dell'endosperma.

[Narratore] Per iniziare, coltiva le piante di Arabidopsis su terra o lana di roccia fino alla fase di fioritura. Segna i fiori completamente aperti con fili colorati per indicare zero giorni dopo la fioritura. Seleziona le silique da 12 a 16 giorni dopo la fioritura per la procedura successiva. Usando le forbici sottili, tagliare le silique marcate in via di sviluppo sul peduncolo e raccoglierle in tubi da 1,5 millilitri. Preparare una carta da filtro bagnata per la dissezione per evitare l'essiccazione e posizionare il campione sotto uno stereomicroscopio. Usando due pinze, una con punte spesse per tenere e l'altra con punte affilate per strappare. Dividere una valvola dal replum. Quindi, utilizzando la pinza con le punte chiuse, raccogliere delicatamente i semi in via di sviluppo dalle silique per evitare di danneggiarli. Utilizzando un ago per iniezione calibro 27, creare una cicatrice di circa 0,1-0,2 millimetri sulla testa e sull'endosperma che circonda l'embrione. Tenere il seme con una pinza senza schiacciarlo e fare la cicatrice all'incrocio dei cotiledoni e radicali. Ora, spingi fuori l'embrione pizzicando il seme con una pinza, facendo attenzione a non schiacciare l'involucro del seme e mantenendo la sua forma rotonda. Inserire l'ago per iniezione nella busta vuota del seme in corrispondenza della cicatrice e perforarla dall'interno verso l'esterno. Quindi, tieni l'ago in posizione e usa una pinza a punta chiusa per graffiare la superficie del Testa. Quindi taglia un lato della busta del seme per consentirne l'apertura. Ora, usando una pinza a punta affilata, apri la busta del seme in un foglio. Il campione isolato dovrebbe ora essere un foglio a doppio strato composto da endosperma e Testa. Metti i semi secchi di Arabidopsis in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungi un millilitro di acqua distillata doppia. Conservare i semi imbevuti per almeno 40 minuti a temperatura ambiente. Preparare una carta da filtro bagnata sul tavolino dello stereomicroscopio per la dissezione e utilizzando una micropipetta da 1000 microlitri, trasferire i semi imbevuti sulla carta da filtro bagnata. Posizionare ora il campione sotto uno stereomicroscopio. Usando un ago per iniezione, fai una cicatrice di circa 0,2 millimetri sulla testa e sull'endosperma che circonda l'embrione. Tieni il seme con una pinza senza schiacciarlo e punta la giunzione tra il cotiledone e il radicale per la cicatrice. Ora spingi fuori l'embrione dopo aver pizzicato il seme con una pinza. Evita di schiacciare la busta del seme vuota e preserva la sua forma rotonda. Utilizzando un ago per iniezione, tagliare sia il lato superiore che quello inferiore dell'involucro del seme vuoto per modellarlo in una forma cilindrica. Quindi, taglia l'involucro cilindrico del seme lungo il suo asse centrale per dividerlo in due pezzi. I risultati dovrebbero essere fogli a doppio strato fatti di endosperma e testa. Posizionare i campioni di endosperma isolati sotto forma di fogli su un vetrino e montarli in acqua. Infine, posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto sul campione assicurandosi che lo strato di endosperma sia rivolto verso l'alto verso il vetrino coprioggetti. Utilizzare smalto per unghie o grasso per sigillare i bordi del vetrino coprioggetti e prevenire l'essiccazione prima di osservare il campione al microscopio. Numerose cellule dell'endosperma e le loro strutture intracellulari sono state visualizzate con successo da semi raccolti a 14 giorni dopo la fioritura utilizzando il protocollo di preparazione stabilito. I corpi fotografici sono stati rilevati all'interno del nucleo delle cellule endospermatiche, esprimendo PHYB-GFP sotto luce bianca, confermando la loro presenza e localizzazione nucleare. Le cellule dell'endosperma hanno mostrato la formazione reversibile di fotocorpi dopo l'alternanza di esposizione alla luce rossa e rossa lontana, confermando la fotoreversibilità del PHYB e l'attività biologica fino a 4,5 ore dopo la dissezione. È stato eseguito l'imaging time-lapse fluorescente dei mitocondri in cellule endospermatiche intatte dopo tre ore di inibizione del seme ed è stato rilevato il movimento mitocondriale. Una motilità mitocondriale più dinamica è stata osservata nelle cellule dell'endosperma dopo un giorno di inibizione del seme, indicando un aumento dell'attività nel tempo.