Trasduzione diffusa dei neuroni neocorticali di topo mediante iniezione subaracnoidea di AAV2

La nostra ricerca è focalizzata sullo sviluppo del metodo che consente la trasduzione virale di grandi volumi di tessuto neurale nella neocorteccia del topo. Tipicamente, la sospensione di particelle virali viene iniettata direttamente nel parenchima cerebrale. Qui la trasfezione dell'area è determinata dalla diffusione delle particelle virali nel tessuto cerebrale, che hanno un intervallo limitato.

Iniettiamo virus vettori virali AAV2 nello spazio subaracnoideo attraverso la superficie cerebrale. Abbiamo scoperto che la somministrazione subaracnoidea del virus ha portato a un aumento di quasi quattro volte dell'area di infezione rispetto all'iniezione intraparenchimale. La nuova tecnica fornisce una diffusa trasduzione dei neuroni neocorticali nei topi adulti e aiuta a preservare il tessuto cerebrale per le successive registrazioni ottiche o elettrofisiologiche dell'attività neuronale.

Il nostro metodo di iniezione consente l'espressione selettiva del transgene in un ampio strato di popolazione di cinque neuroni piramidali, anche quando si utilizza un forte promotore non selettivo. Tuttavia, il meccanismo di tale selettività non è completamente compreso. Per iniziare, fissa i denti anteriori di un topo anestetizzato nella barra dei denti e monta la maschera dell'animale.

Posizionare con cautela il mouse sulle barre auricolari. Radere la testa dagli occhi a dietro le orecchie, quindi tamponare la superficie rasata con etanolo al 70%, seguito da una soluzione alcolica al 5% di iodio. Applicare una soluzione sterile di lidocaina al 4% per via topica e iniettare 0,02 millilitri di desametasone per via sottocutanea per ridurre il dolore e l'infiammazione.

Con un bisturi sterile e delle forbici, praticare un'incisione sulla linea mediana da quattro a cinque millimetri iniziando tra le orecchie per aprire il cuoio capelluto. Espandi l'incisione usando le forbici per evitare danni al cranio. Tamponare la superficie del cranio con perossido di idrogeno al 3% per visualizzare bregma e lambda.

Interrompere immediatamente la reazione con soluzione salina di cloruro di sodio allo 0,9%. Quindi utilizzare un raschietto osseo per rimuovere il tessuto dalla superficie del cranio. Montare l'iniettore motorizzato pre-preparato con una siringa Hamilton sul braccio stereotassico.

Illuminare il cranio esposto utilizzando una fonte di luce chirurgica e mettere a fuoco il microscopio sul bregma. Guardando attraverso il microscopio, manipolare il braccio stereotassico per allineare la punta dell'ago direttamente sul bregma. Allineare bregma e lambda orizzontalmente utilizzando la punta dell'ago.

Torna a Bregma e registra le coordinate. Sposta l'ago sulle coordinate calcolate. Abbassarlo nella nuova posizione e contrassegnarlo.

Selezionare il sito per l'iniezione virale vicino al bersaglio considerando la diffusione virale. Ora, usa una fresa dentale sterile di 0,5-0,8 millimetri di diametro per creare una piccola craniotomia mentre guardi attraverso il microscopio. Utilizzare aria pressurizzata per soffiare via la polvere ossea.

Bagnare il foro con soluzione fisiologica sterile e rimuovere l'eccesso con un batuffolo di cotone. Quindi utilizzare un ago calibro 27 con punta a forma di uncino o una pinzetta sottile per rimuovere l'osso rimanente, facendo attenzione a non danneggiare la dura. Copri il cranio con un tovagliolo di carta sterile inumidito con soluzione salina.

Quindi, posizionare una pellicola trasparente sterile sopra la superficie del cranio. Spostare indietro il braccio stereotassico e allineare l'ago della micro siringa sopra la pellicola trasparente. Quindi erogare l'olio in eccesso fino a quando rimangono due microlitri.

Pipettare il volume di iniezione virale e altri due microlitri di virus sulla pellicola trasparente. Guardando attraverso il microscopio, abbassare la punta dell'ago al centro della goccia di virus. Ora carica il virus nella micro siringa con un iniettore motorizzato.

Rimuovere la carta inumidita dal cranio e asciugare l'area con un batuffolo di cotone. Riposizionare il braccio stereotassico e l'ago sopra il sito di inserimento. Quindi, erogare una goccia di virus per verificare la presenza di ostruzioni dell'ago.

Fai una piccola fessura nella dura madre usando un ago calibro 30 con una punta a forma di uncino. Abbassare l'ago della siringa fino alla dura madre e calcolare la profondità di inserimento in base al punto di contatto della superficie. Inserire lentamente l'ago nella corteccia a una profondità di 300 micrometri, attendere due o tre minuti, ritrarre a 200 micrometri e attendere altri due o tre minuti.

Iniziare l'iniezione virale a 0,06 microlitri al minuto per un totale di un microlitro. Dopo l'infusione, tenere l'ago nel sito bersaglio per 10 minuti per consentire la dispersione del virus. Quindi ritrarre lentamente l'ago per evitare il riflusso.

Erogare una goccia di virus per verificare che l'ago non sia ostruito. Chiudere l'incisione del cuoio capelluto utilizzando suture 5-0 riassorbibili o non assorbibili. La somministrazione subaracnoidea di un AAV2 ha portato a un'area significativamente più ampia di infezione neuronale rispetto all'iniezione intracorticale tradizionale, con un'espansione di quasi quattro volte sia in direzione mediolaterale che rostrocaudale.

L'iniezione di virus subaracnoide ha provocato una forte marcatura fluorescente verde dei neuroni negli strati corticali due, tre e cinque, mentre gli strati quattro e sei non mostravano corpi cellulari marcati ma mostravano rispettivamente dendriti e assoni visibili. Le particelle fluorescenti che sono state aggiunte alla sospensione virale iniettata durante l'iniezione subaracnoidea sono state trovate lungo la superficie del cervello, indicando la diffusione del virus attraverso il liquido cerebrospinale, con una copertura superficiale più ampia rispetto alla marcatura neuronale. L'ampia distribuzione superficiale della fluorescenza verde nelle sezioni frontali ha confermato un'infezione corticale diffusa dopo l'iniezione subaracnoidea, in contrasto con la piccola infezione localizzata osservata con l'iniezione standard.

Negli strati super granulari, una frazione sostanziale di neuroni trasdotti co-esprimeva parvalbumina o calbindina, mentre nessun interneurone co-marcato è stato rilevato nel quinto strato e tutte le cellule infette erano rappresentate esclusivamente da neuroni piramidali.