Sintesi di vescicole unilamellari giganti composte: un modello biomimetico di cellule nucleate

Questo articolo presenta un metodo per la preparazione di vescicole unilamellari giganti composte (cGUV) con una struttura vescicola nella vescicola, con conducibilità elettrica personalizzata nelle regioni interne, anulari ed esterne. L'elettroformazione sintetizza semplici GUV, che vengono trasformati in stomatociti e cGUV tramite shock osmotico, fornendo un modello prezioso per lo studio della biofisica delle cellule nucleate.

Abbiamo condotto uno studio approfondito sulla sintesi e l'elettroidrodinamica di vescicole unilamellari giganti composte per stabilirle come equivalenti biomagnetici delle cellule eucariotiche. Il tentativo è quello di comprendere le tecnologie che coinvolgono l'applicazione del campo elettrico alle celle biologiche, come l'elettroporazione cellulare e l'elettrodeformazione cellulare.

Per far progredire la ricerca in questo settore viene impiegata una combinazione di microscopia a fluorescenza e microscopia ottica, trattamenti elettrici a impulsi di nanosecondi, oscilloscopio e fonti di alimentazione e metodi di sintesi innovativi. La sfida nella sintesi di GUV composti ben formati è la sensibilità di un metodo a una temperatura, ai tipi di lipidi e alla composizione utilizzata. In questo lavoro, dimostriamo questo per un sistema DMPC e colesterolo, ma generalizzarlo rimane impegnativo. In letteratura sono stati sintetizzati semplici GUV che imitano una cellula nucleica. Sintetizziamo la vescicola gigante composta per emulare una cellula nucleata con la struttura di difesa della valvola, che racchiude una vescicola interna di circa la metà delle dimensioni della vescicola esterna.

Ci concentreremo sullo studio dell'effetto di impulsi micro e nanosecondi sulla vescicola interna, che è un imitatore del nucleo di una cellula biologica nel contesto dell'elettroporazione.

[Narratore] Per iniziare, pulire accuratamente i vetrini rivestiti di ossido di indio e stagno o ITO utilizzando una soluzione di detersivo per piatti e risciacquare con acqua deionizzata con una conduttività di 0,055 microsiemens per centimetro. Quindi, utilizzando una soluzione di etanolo al 100%, pulire nuovamente i vetrini e risciacquare con acqua deionizzata. Asciugare le diapositive in forno a 85 gradi Celsius. Identificare il lato conduttivo di ogni vetrino rivestito in ITO utilizzando una pinza amperometrica. Fissare la slitta pulita sullo stadio di spin coder utilizzando un aspirapolvere, assicurandosi che il lato conduttivo sia rivolto verso l'alto. Applicare 25 microlitri di soluzione lipidica, una o quattro goccioline sul lato conduttivo di un vetrino ITO. Prendi un altro vetrino e applica 25 microlitri di soluzione lipidica due allo stesso modo. Asciugare sotto vuoto entrambi i vetrini rivestiti di lipidi in un essiccatore conservato al buio per un minimo di due ore. Quindi disporre un vetrino ITO rivestito di lipidi con uno lipidico in parallelo con un vetrino pulito, assicurandosi che i lati conduttivi siano uno di fronte all'altro, e posizionare un distanziatore in gomma siliconica di tre millimetri di spessore tra di loro. Sigillare l'impianto con un morsetto per creare una camera di elettroformazione. Riempire ora la camera con una soluzione di saccarosio da 100 millimolari utilizzando una siringa da due millilitri. Collegare il cavo di uscita del generatore di funzioni alle slitte rivestite in ITO con il generatore di funzioni. Posizionare entrambe le camere di elettroformazione in un incubatore mantenuto tra i 38 e i 40 gradi Celsius. Applicare un campo elettrico in corrente alternata di cinque volt picco-picco a una frequenza di 10 hertz utilizzando un generatore di funzioni a doppio canale per quattro ore. Dopo l'incubazione, scollegare le camere di elettroformazione dal generatore di funzioni. Toglieteli dall'incubatrice e lasciateli raffreddare a temperatura ambiente. Utilizzando una siringa, raccogliere le vescicole unilamellari giganti sintetizzate da ciascuna camera e trasferirle in provette per microcentrifuga separate da due millilitri. Incubare le provette a temperatura ambiente tra i 25 e i 27 gradi Celsius per un'ora prima di procedere allo shock osmotico. Trasferire 200 microlitri di semplici vescicole unilamellari giganti, o sGUV, sospese in un terreno idratante contenente una soluzione di saccarosio da 100 millimolari nella camera di osservazione e introdurre 125 microlitri di soluzione di glucosio da 300 millimolari per indurre lo shock osmotico e avviare le transizioni di forma. Lasciare riposare per un'ora gli sGUV, ora sottoposti a shock osmotico, all'interno della camera di osservazione posta sul tavolino di microscopia. Eseguire la microscopia differenziale a contrasto, interferenza e epifluorescenza utilizzando un microscopio invertito dotato di una fotocamera monocromatica. Utilizzare le lenti dell'obiettivo Plan Fluor a distanza di lavoro extra-lunga 20X x 0,45 e 40X x 0,60 per osservare le transizioni di forma negli sGUV. Per l'epifluorescenza, utilizzare un set di filtri verdi con eccitazione da 510 a 560 nanometri, uno specchio dicroico a 575 nanometri e un filtro barriera a 590 nanometri per i doppi strati colorati con Niall Red. Monitora le transizioni di forma all'interno della camera di osservazione utilizzando la microscopia a contrasto interferenziale differenziale e la microscopia a epifluorescenza con lenti obiettivo Plan Fluor. Osservare la formazione di vescicole stomatocitiche mentre procede la transizione di forma. Monitora come si depositano prima le vescicole più grandi, seguite da un aumento del numero di vescicole più piccole nel tempo. Successivamente, aggiungere una soluzione salina per regolare la conducibilità in diverse regioni dei cGUV prima di indurre lo shock osmotico. Ad esempio, per creare una conduttività più elevata nelle regioni esterne e interne rispetto alla regione anulare, trasferire 200 microlitri di soluzione di saccarosio nella camera di elettrofusione. Aggiungere 20 microlitri di soluzione salina da 7,5 millimolari nella camera e indurre lo shock osmotico con 125 microlitri di soluzione di glucosio da 300 millimolari. Lasciare riposare gli sGUV d'urto osmotico nella camera per tre o quattro ore. Confermare che i cGUV risultanti hanno una conduttività più elevata nelle regioni esterne e interne rispetto alla regione anulare. Per eseguire l'elettrodeformazione dei cGUV, distanziare gli elettrodi a filo di 500 micrometri l'uno dall'altro e applicare un potenziale elettrico in corrente alternata di 7,5 volt picco-picco a 100 kilohertz utilizzando un generatore di funzioni. Dopo aver applicato il campo elettrico, acquisire video a 10 fotogrammi al secondo e osservare la deformazione oblata delle vescicole esterne e la deformazione prolata delle vescicole interne. Quindi caricare la miscela cGUV in un vetrino per cavità e sigillare con un vetrino coprioggetti per evitare movimenti. Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser per analizzare la morfologia del cGUV attraverso la scansione dell'asse Z con una dimensione del passo di un micrometro. Per l'imaging è possibile utilizzare un obiettivo Plan Apochromat 40X con 1,3 DIC a olio. Utilizzare una modalità a canale singolo rosso con eccitazione a 561 nanometri ed emissione da 561 a 695 nanometri per ottenere immagini di cGUV colorato con Niall Red o Rhodamine PE. Modificare ed estrarre . File immagine CZI utilizzando il software collegato al microscopio. Inserisci elementi grafici come le barre di scala e abilita le viste 2D e 3D. Quindi vai al metodo di elaborazione e ai parametri per regolare le impostazioni desiderate. Quindi fare clic su Applica per esportare l'immagine in formato JPG. Infine, aprire il file nel software ImageJ. Per inserire una barra di scala, vai su analizza, quindi imposta scala per calibrare, quindi seleziona analizza seguito da strumenti e barra di scala per applicarla. L'imaging confocale Z-stack ha confermato che le vescicole interne erano completamente separate dalle vescicole esterne ed elevate nel piano Z a causa della minore densità della soluzione interna. Lo stato intermedio degli stomatociti mostrava un collo stretto che collegava le vescicole interne ed esterne prima della completa separazione. Sei ore dopo lo shock osmotico è stata osservata una popolazione diversificata di forme vescicolari, tra cui più vescicole interne, corpi a forma di stella e strutture tubolari. Un'elevata abbondanza di cGUVs è stata formata utilizzando una miscela lipidica di 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina e colesterolo in un rapporto da 63 a 37 molari. Sotto un campo elettrico a corrente alternata, i cGUV hanno mostrato deformazione con la vescicola esterna che forma una forma oblata e la vescicola interna che forma una forma prolata.