Modello murino di malattia epatica steatosica associata a disfunzione metabolica con fibrosi
18 luglio 2025
Modello murino di malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) con disfunzione metabolica, alterazioni dell'espressione genica epatica e alterazioni istopatologiche epatiche che assomigliano alla MASLD umana, inclusa la fibrosi che progredisce allo stadio 3 di fibrosi avanzata. Questo modello può essere utilizzato negli studi di fisiopatologia della MASLD e negli studi preclinici di nuove terapie.
Nella nostra ricerca, ci concentriamo sulla steatotica hepatica associata a disfunzioni metaboliche, o MASLD, e in particolare sui meccanismi di accumulo e fibrosi lipidica. Alcuni degli sviluppi recenti sono la trascritomica a cellule singole e speciali, la standardizzazione dei modelli animali di MASLD e l'approvazione del semaglutide per il trattamento di MASLD. Esistono molti modelli animali di MASLD, ma abbiamo scoperto che molti non inducevano fibrosi epatica.
Quindi, per affrontare questo punto, abbiamo sviluppato il nostro modello murino di MASLD. Il nostro modello murino induce la MASLD con fibrosi nutrendo i topi iperfagici con una dieta simile alla dieta media americana. Questo causa MASLD molto simile alla malattia umana.
Il nostro metodo faciliterà studi sulla fisiopatologia della MASLD e la sperimentazione di nuove terapie. Per cominciare, ottenere una sezione di tessuto epatico incorporato in paraffina su un vetrino. Per la deparaffinizzazione, immergi il vetrino in xilene o citrisolv per cinque-quindici minuti.
Poi reidrata la sezione in serie con etanolo al 100, 95 e 70%, seguita da acqua distillata per cinque minuti in ciascuna. Poi tingi la sezione con Sirius Red e disidrata il vetrino. Rimuovi un vetrino alla volta dalla soluzione di pulizia e tamponalo su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.
Aggiungi circa 50-100 microlitri di mezzo di montaggio alla sezione. Copri la sezione con un slip di copertura e premila delicatamente per rimuovere le bolle d'aria. Lascia asciugare il diavolo all'aria.
Ora, osserva la sezione preparata al microscopio luminoso con illuminazione a campo chiaro usando obiettivi da 4x a 20x. Trasferire circa 500-1000 microlitri di omogeneato epatico in tubi centrifughe da 1,5 millilitri e aggiungere acido tricloroacetico per raggiungere una concentrazione finale del 12%. Vortice brevemente il tubo per mescolare i contenuti. Incubare il tubo in un bagno d'acqua ghiacciato per 30 minuti e centrifugarlo a 6.000 g a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Poi rimuovi il soprantantante con una pipetta. Aggiungi un millilitro di etanolo al 100% freddo per lavare il pellet e sonicalo per risospendere completamente. Dopo aver centrifugato nuovamente la sospensione, aspirare il sovrandante.
Dopo il terzo lavaggio, tieni il tubo aperto per far asciugare il pellet all'aria per 10 minuti o più a seconda di necessario. Poi aggiungi 800 microlitri di 6 normali acidi cloridrici al tubo contenente la pellet proteica e risospendi il pellet usando un sonicatore come dimostrato in precedenza. Trasferisci la sospensione su un tubo di vetro a vite o una fiala e sigilla bene il tappo.
Incubare il tubo in forno a 110 gradi Celsius per circa 22 ore. Se necessario, trasferire il contenuto dalla fiala di vetro a un tubo centrifuga prima di centrifugare. Centrifugare il campione idrolizzato a 16.000 g per 10 minuti e aspirare il surnatante contenente idrossiprolina in un tubo da 1,5 millilitri.
Per l'ossidazione dell'idrossiprolina, aggiungere 450 microlitri di soluzione di clorammina ai tubi con 50 microlitri di campione e standard. Mescola il contenuto nei tubi con un vortice e incubali a temperatura ambiente per 25 minuti. Poi aggiungi 500 microlitri del reagente di Ehrlich a ogni campione e standard.
Dopo il vortice, incubare i campioni a 65 gradi Celsius per 20 minuti in un incubatore. Dopo l'incubazione, lascia raffreddare i tubi alla temperatura ambiente e osserva il colore finale dei campioni. Infine, misurare l'assorbanza di campioni e standard utilizzando uno spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 550 nanometri.
La colorazione al collagene del tessuto epatico con il rosso Picro Sirius, osservata con illuminazione di campo brillante, ha mostrato rosso collagene con uno sfondo arancione chiaro o giallo. La deposizione di collagene corrispondente alla fibrosi è stata colorata, così come il collagene nelle pareti dei vasi sanguigni, nell'ilo e nella capsula epatica. La microscopia a luce polarizzata ha rivelato fibre di collagene birifringenti distinte su uno sfondo scuro, migliorando la visualizzazione della fibrosi.
La quantificazione dell'area positiva al collagene epatico nei topi gialli agouti alimentati con dieta ad alto contenuto di grassi e fruttosio, o HFFD, ha mostrato una fibrosi significativamente più alta rispetto ai topi di controllo selvatici nutriti con dieta a basso contenuto di grassi e fruttosio. La quantificazione del contenuto epatico di idrossiprolina ha rivelato un livello significativamente più alto nei topi gialli agouti alimentati con dieta HFFD rispetto ai topi di controllo dopo 16 settimane di dieta, confermando un aumento della deposizione di collagene nei fegati fibrotici.
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Panoramica
Questo studio presenta un modello murino di steatosi epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) che riproduce in modo fedele la MASLD umana, inclusa la progressione verso una fibrosi avanzata. Il modello è fondamentale per lo studio della fisiopatologia della MASLD e per la valutazione di nuovi approcci terapeutici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Dysfunzione metabolica
- Malattia epatica
- Modelli animali
Contesto
- La MASLD è caratterizzata dall'accumulo di lipidi e dalla fibrosi epatica.
- I modelli animali esistenti spesso non riescono a indurre la fibrosi epatica.
- I recenti progressi includono la singola cellula e la trascrittomica spaziale.
- Il semaglutide è stato approvato per il trattamento della MASLD.
Scopo dello studio
- Sviluppare un modello murino affidabile di MASLD che induca fibrosi.
- Studiare i meccanismi alla base dell'accumulo di lipidi e della fibrosi.
- Facilitare studi pre-clinici su potenziali terapie per la MASLD.
Metodi Utilizzati
- Somministrare a topi iperfagici una dieta simile alla dieta media americana.
- Monitorare i cambiamenti nell'espressione genica epatica.
- Valutare le alterazioni istopatologiche del fegato.
- Analizzare il progresso degli stadi di fibrosi.
Risultati principali
- Il modello murino ha indotto con successo la MASLD con fibrosi.
- Le alterazioni istopatologiche erano simili a quelle osservate nella MASLD umana.
- La fibrosi è progredita fino allo stadio avanzato 3.
- Questo modello può essere utilizzato per ulteriori ricerche sulle terapie della MASLD.
Conclusioni
- Il modello murino sviluppato è uno strumento prezioso per lo studio della MASLD.
- Fornisce informazioni sui meccanismi fisiopatologici della malattia.
- Questo modello può essere utile nella valutazione di nuove strategie terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Modelli preclinici solidi in grado di riprodurre la steatosi epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) con fibrosi sono essenziali per la scoperta traslazionale di farmaci e la riduzione dei rischi meccanicistici. Questo modello murino consente una valutazione quantitativa della progressione della fibrosi e della disfunzione metabolica, sostenendo la fiducia predittiva nella valutazione terapeutica precoce. L'allineamento con la patologia della malattia umana migliora la selezione del portafoglio e le decisioni di avanzamento corrette per il rischio nei percorsi di malattie metaboliche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette l'analisi dei percorsi fibrogenici e delle disfunzioni metaboliche in un sistema rilevante per la malattia.
- Consente la validazione funzionale degli obiettivi modellando una fibrosi progressiva e fenotipi metabolici.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistica per i bersagli candidati coinvolti nella MASLD.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce endpoint istologici e biochimici validati per la quantificazione della fibrosi.
- Consente una valutazione riproducibile dell'efficacia dei composti mediante colorazione con rosso picrosirio e misurazione dell'idrossiprolina.
- Supporta la standardizzazione dei saggi per garantire confrontabilità tra studi e tra gruppi di ricerca.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati preclinici con l'istopatologia MASLD umana e i cambiamenti nell'espressione genica.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di interventi antifibrotici e metabolici.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali rispecchiando la progressione della malattia umana.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello collega la fase iniziale della scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e la validazione preclinica per i farmaci contro la MASLD, fornendo endpoint quantitativi e pertinenti alla malattia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi fibrogenici e sul disfunzionamento metabolico in vivo.
- Screening: Fornisce letture quantitative e standardizzate della fibrosi e del profilo metabolico per la valutazione di composti.
- Analisi: Permette il confronto statistico della gravità della fibrosi e dei parametri metabolici tra gruppi sperimentali diversi.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei risultati preclinici con la patologia e l'espressione genica della MASLD umana.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per test iterativi di diverse modalità terapeutiche rivolte alla MASLD.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi per la MASLD.
- Valore operativo: Standardizza la quantificazione della fibrosi e il fenotipaggio metabolico per ottenere risultati riproducibili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'allocazione del capitale fornendo evidenze precliniche solide.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei candidati per la MASLD adeguata al rischio, basata sulla rilevanza traslazionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'utilizzo degli animali, nella colorazione istologica e nella quantificazione biochimica.
- Necessita dell'accesso a microscopia, spettrofotometria e infrastrutture analitiche per la misurazione degli endpoint.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda dieta, cura degli animali e protocolli dei saggi, al fine di garantire la riproducibilità.
- L'adattamento ad altri ceppi di topi o a diverse diete potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
- La durata del modello e i tempi di progressione della fibrosi devono essere considerati nella progettazione dello studio.
