Isolamento e valutazione citofluorimetrica delle interazioni neuroimmunitarie in un modello murino di mini-ictus
20 giugno 2025
Qui, presentiamo un protocollo per valutare la funzione delle cellule immunitarie dopo ictus ischemico utilizzando l'analisi citofluorimetrica in un modello di mini-ictus. Questo metodo consente un esame dettagliato delle interazioni neuroimmunitarie e può essere adattato per lo studio di altre malattie neurodegenerative, migliorando la nostra comprensione delle risposte immunitarie nella patologia dell'ictus.
L'ambito della nostra ricerca si concentra sulla funzione delle cellule immunitarie a seguito di ictus ischemico. Il nostro obiettivo è comprendere le leggi delle cellule immunitarie residenti e infiltranti nella patologia dell'ictus. Attualmente, la citometria a flusso è ampiamente utilizzata per valutare la funzione delle cellule immunitarie e le interazioni nelle neuroinfiammazioni.
Inoltre, le tecniche immunologiche e il sequenziamento di singole cellule stanno facendo progredire la ricerca sulle interazioni neuroimmunitarie. Il nostro laboratorio si concentrerà sull'illustrazione del percorso degli astrociti nelle interazioni neuro immunitarie, nei contributi angioici ai processi neuroinfiammatori. Per iniziare, prendi una siringa da 50 millilitri e attacca un ago calibro 26 alla sua estremità.
Riempire completamente la siringa con soluzione salina. Posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina su un pannello di schiuma. Estendere gli arti anteriori e posteriori e fissarli con aghi calibro 26.
Usando una pinza per pollice seghettata, afferra la pelle addominale e fai un'incisione laterale per esporre il fegato. Taglia lungo entrambi i lati delle costole per esporre il cuore. Ora inserisci l'ago calibro 26 nel ventricolo sinistro e recidi l'oracolo destro.
Premere lo stantuffo della siringa per consentire al sangue di defluire. Continuare la perfusione fino a quando il sangue che fuoriesce dall'oracolo appare chiaro. Dopo aver decapitato il topo ed estratto il cervello, trasferirlo in una matrice cerebrale di acciaio di topo e sezionarlo in fette corneali consecutive di due millimetri di spessore.
Introdurre 500 microlitri di miscela di enzimi di digestione in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Usando una micro pinza, separare delicatamente il tessuto dell'infarto e trasferirlo nella miscela di enzimi per la digestione. Infine, frammentare il tessuto con le forbici oftalmiche nei pezzi più piccoli possibili e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Utilizzando la pipetta AP 1000, aspirare delicatamente e dosare la soluzione 10 volte per dissociare il tessuto in singole cellule. Quindi passare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri. Sciacquare ripetutamente sia la piastra a 12 pozzetti che il colino cellulare con HBSS ghiacciato contenente calcio e magnesio.
Centrifugare ora la sospensione cellulare raccolta a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in un millilitro di PBS.
Dopo aver ripetuto il processo di centrifugazione, risospendere nuovamente il pellet in 150 microlitri di PBS e trasferire la sospensione in una piastra di fondo rotonda da 96 pozzetti. Centrifugare nuovamente a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, afferrare saldamente la piastra a 96 pozzetti e capovolgerla rapidamente per scartare il surnatante.
Successivamente, diluire il die di fluorescenza di vitalità cellulare in un rapporto da uno a cento in PBS e risospendere il pellet in 150 microlitri della soluzione colorante diluita. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente proteggendo la piastra dalla luce. Dopo aver centrifugato per cinque minuti a quattro gradi Celsius, scartare il surnatante.
Diluire il cocktail di anticorpi sulla superficie cellulare in smistamento cellulare attivato magneticamente o tampone max e, senza lavare le cellule, aggiungere il cocktail di anticorpi ai pozzetti. Incubare per 15-20 minuti a quattro gradi Celsius prima di centrifugare per altri cinque minuti. Dopo aver centrifugato la piastra e scartato il surnatante, risospendere il pellet in 150 microlitri di tampone massimo.
Trasferire la sospensione in provette da centrifuga da 1,5 millilitri o in provette da cinque millilitri di polistirene a fondo tondo. Progetta un pannello di citometria a flusso multicolore in base alla configurazione dello strumento utilizzando metodi manuali o uno strumento di progettazione di pannelli online. Includere un colorante per la vitalità cellulare nel pannello per escludere cellule e detriti non vitali dai dati.
Regolare le impostazioni del rilevatore di dispersione diretta e laterale per garantire che le celle di interesse vengano visualizzate correttamente e possano essere controllate correttamente. Regola con precisione i parametri FSC e SSC per eliminare detriti e rumori estranei. Su un grafico a punti che mostra l'area FSC rispetto all'altezza, distinguere i doppietti dalle celle singole.
Utilizzare il segnale negativo del colorante vitale per isolare le cellule vitali. Confrontare il controllo dell'autofluorescenza delle cellule non colorate con i controlli positivi delle cellule colorate per confermare che le cellule colorate siano scalate correttamente per ciascun parametro. Ottimizza la compensazione analizzando campioni di celle multicolore ed esaminando due grafici a punti colorati.
Regolare le impostazioni di compensazione verso l'alto o verso il basso fino a quando le popolazioni di cellule non si allineano verticalmente o orizzontalmente tra loro. Utilizzare i segnali CD45 e CD11B per distinguere tra linfociti, microglia, cellule mieloidi e astrociti in base ai loro specifici modelli di espressione. Utilizzare il tessuto cerebrale fittizio come controllo dell'autofluorescenza per fungere da riferimento per l'identificazione dei linfociti.
Se si analizza un bersaglio specifico, utilizzare un controllo FMO con tessuto cerebrale post-ictus. Raccogli i dati di controllo e salvali. Allo stesso modo, raccogliere i dati di esempio e salvarli.
Seleziona e ordina le popolazioni di cellule bersaglio in provette di polistirene a fondo tondo da cinque millilitri o provette da centrifuga coniche da 15 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di PBS e risciacquare la provetta di raccolta per preservare la vitalità cellulare e favorire la formazione di pellet. Le microglia CCR7 positive e CD11c positive sono state quantificate il secondo e il settimo giorno dopo l'ictus ischemico.
L'espressione di CCR7 nella microglia è aumentata bruscamente il secondo giorno ed è rimasta elevata il settimo giorno rispetto ai controlli fittizi. La microglia CD11c positiva ha seguito una tendenza simile, raggiungendo il picco al secondo giorno e rimanendo più alta dello sham il settimo giorno. I dot plot hanno mostrato densi segnali CCR7 e CD11c nei giorni due e sette.
In contrasto con i segnali sparsi nei controlli fittizi. Una strategia di gating ha separato le cellule mieloidi della microglia e i linfociti utilizzando l'espressione di CD11B e CD45. Ulteriori marcatori hanno definito cellule vitali, astrociti e sottogruppi di linfociti.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la valutazione della funzione delle cellule immunitarie dopo un ictus ischemico mediante analisi citometrica in un modello di mini-ictus. Il metodo consente un'esame dettagliato delle interazioni neuroimmunitarie e può essere adattato per la ricerca su diverse malattie neurodegenerative, migliorando così la comprensione delle risposte immunitarie nella patologia dell'ictus.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Patologia dell'ictus
Sfondo
- Comprendere le risposte immunitarie nell'ictus ischemico è fondamentale per lo sviluppo di terapie.
- Le interazioni neuroimmunitarie sono un fattore chiave che influenza l'esito dell'ictus.
- I modelli esistenti spesso presentano carenze nelle capacità di analisi dettagliata delle funzioni immunitarie.
- Questo studio mira a colmare tale lacuna utilizzando la citometria in flusso.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la valutazione della funzione delle cellule immunitarie dopo un ictus ischemico.
- Studiare le interazioni neuroimmunitarie in un modello di mini-ictus.
- Migliorare la comprensione delle risposte immunitarie nelle malattie neurodegenerative.
Metodi Utilizzati
- È stata impiegata un'analisi mediante citometria a flusso, che ha permesso un esame dettagliato delle funzioni delle cellule immunitarie.
- È stato utilizzato un modello di mini-ictus per simulare condizioni ischemiche.
- Nel testo non sono stati menzionati flussi di lavoro per analisi multi-omiche o metaboliche.
- Non sono stati forniti passaggi procedurali dettagliati relativi al protocollo.
- È stata evidenziata l'adattabilità del metodo a diverse malattie neurodegenerative.
Risultati principali
- Il protocollo consente una valutazione dettagliata delle risposte delle cellule immunitarie in seguito a ictus ischemico.
- I risultati suggeriscono informazioni significative sulle interazioni neuroimmunitarie durante l'ictus.
- Un'importante osservazione è l'adattabilità a altre malattie neurodegenerative.
- Le conclusioni rafforzano l'importanza della comprensione della dinamica immunitaria nella patologia dell'ictus.
Conclusioni
- Questo studio dimostra una metodologia solida per analizzare le risposte immunitarie negli ictus.
- L'approccio approfondisce la comprensione dei meccanismi immunitari rilevanti per la neurodegenerazione.
- I risultati hanno implicazioni per lo sviluppo di terapie mirate nella gestione dell'ictus.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione quantitativa mediante citometria a flusso delle interazioni neuroimmunitarie in un modello murino di mini-ictus consente una caratterizzazione precisa dell'attivazione e dell'infiltrazione delle cellule immunitarie a seguito di lesione ischemica. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi terapeutici per patologie guidate da neuroinfiammazione, informando le decisioni iniziali relative al portafoglio nei percorsi di malattie neurodegenerative e cerebrovascolari. L'adattabilità del protocollo attraverso diversi modelli di malattia migliora la continuità traslazionale e la fiducia predittiva per strategie terapeutiche immunomodulanti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei meccanismi neuroimmunitari alla base del danno ischemico e della neurodegenerazione.
- Supporta la validazione funzionale delle target quantificando gli stati di attivazione delle cellule immunitarie dopo un ictus.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico per target immunomodulanti nelle patologie del sistema nervoso centrale.
- Fornisce dati per informare la valutazione predittiva e il triage di asset nelle fasi iniziali di sviluppo.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce flussi di lavoro validati per la sospensione di singole cellule e la marcatura con anticorpi, finalizzati a un profilo immunitario riproducibile.
- Fornisce letture quantitative multiparametriche adatte alla standardizzazione dei saggi e allo screening successivo.
- Consente la fenotipizzazione scalabile delle cellule immunitarie per la valutazione di composti in contesti neuroinfiammatori.
- Permette il riutilizzo della piattaforma in modelli di malattie neurodegenerative.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea il profilo delle cellule immunitarie a endpoint rilevanti per la malattia in modelli preclinici di ictus e neurodegenerazione.
- Consente una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di bersagli neuroimmunitari.
- Supporta decisioni di avanzamento basate su rischi, fondate su parametri di attivazione e infiltrazione immunitaria.
- Facilita l'identificazione di biomarcatori traslazionali per i processi neuroinfiammatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, sostenendo la validazione del bersaglio, l'elucidazione dei meccanismi immunitari e lo sviluppo di saggi quantitativi per programmi su malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative.
- Biologia della scoperta: Fornisce dati robusti sull'attivazione e l'infiltrazione delle cellule immunitarie per la verifica di ipotesi e la chiarificazione dei percorsi molecolari.
- Screening: Fornisce output riproducibili e quantitativi del profilo immunitario per la preparazione dei saggi e lo screening di composti.
- Analisi: Permette il confronto statistico delle popolazioni di cellule immunitarie tra diverse condizioni sperimentali e punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei risultati immunologici preclinici con biomarcatori rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro standardizzato e adattabile per il profilo immunitario in diversi modelli di malattie del sistema nervoso centrale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione di bersagli neuroimmunitari.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di isolamento delle cellule immunitarie e di citometria a flusso per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'allocazione del capitale fornendo metriche quantitative sull'attivazione immunitaria.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione, corretta per rischio, di asset per malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in neuroanatomia, biologia delle cellule immunitarie e analisi mediante citometria a flusso.
- Richiede l'accesso a citometri a flusso ad alto parametro e a pannelli di anticorpi validati.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di elaborazione dei tessuti e le strategie di gating.
- È adattabile a diversi modelli di malattie del sistema nervoso centrale, con ottimizzazione del protocollo in base al tipo di tessuto e al contesto patologico.
- L'interpretazione dei dati di profilazione immunitaria può richiedere saggi funzionali complementari.
