Esplorazione degli eventi cellulari sequenziali della fagocitosi innescata da Godanti Bhasma nelle cellule di mammifero

Fagocitosi, in cui un fagocita ingerisce e scompone particelle estranee. È fondamentale per la difesa immunitaria. Sono necessari metodi migliorati e di facile utilizzo per monitorare e valutare in modo efficiente questo complesso processo cellulare.

L'acquisizione di eventi di degradazione in tempo reale e l'eliminazione di artefatti da fotobleaching rimangono sfide chiave per studiare accuratamente la fagocitosi e il traffico intracellulare. A differenza delle particelle fluorescenti o sintetiche, il nostro protocollo utilizza Godanti Bhasma, una particella label-free che consente la visualizzazione diretta degli stadi di fagocitosi senza fotosbiancamento, ottimizzazione o preparazione complessa. Questi risultati forniscono un modello riproducibile per sezionare i meccanismi fagocitici, offrendo nuovi strumenti per studiare la dinamica vescicolare, la disfunzione dei patogeni e il potenziale intervento terapeutico per i disturbi immunitari e lisosomiali.

Il nostro obiettivo è quello di esplorare i regolatori molecolari del fagosoma di maturazione, studiare la disfunzione fagocitaria in modelli di malattia e vagliare potenziali farmaci che modulano la dinamica vescicolare e il traffico intracellulare. Per iniziare, pesa esattamente 100 milligrammi di polvere Godanti Bhasma o GB. Sospendi la polvere in 10 millilitri di DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina.

Agitare accuratamente la sospensione per mescolare il contenuto e lasciare riposare la miscela per un minuto per consentire alle particelle più grandi di depositarsi sul fondo. Utilizzando una pipetta, trasferire i cinque millilitri superiori della sospensione in una provetta da centrifuga sterile. Etichettare i cinque millilitri di sospensione GB trasferita come soluzione madre per ulteriori lavori di coltura cellulare.

Agitare nuovamente accuratamente la sospensione per garantire una dispersione uniforme delle particelle prima di aggiungerla alle celle. Seed 3 10 to the fourth alimenta le cellule 3T3-L1 in un piatto da 35 millimetri contenente due millilitri di DMEM. Incubare la capsula a 37 gradi Celsius in un'atmosfera del 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza.

Quindi mescolare accuratamente 300 microlitri della sospensione stock GB in due millilitri di terreno di coltura fresco preriscaldato. Posizionare il piatto di coltura contenente le cellule e la sospensione GB sull'incubatore del microscopio per immagini. Selezionare l'obiettivo 10x sul microscopio.

Attivare l'illuminazione in campo chiaro utilizzando il pulsante Bright. Quindi avviare il software DIGI ImagePlus e selezionare la fotocamera appropriata. Fai clic sul pulsante Cattura e scegli l'opzione time lapse.

Impostare l'intervallo di tempo su cinque minuti e avviare la registrazione facendo clic sul pulsante Fine. Cattura immagini in campo chiaro a intervalli di cinque minuti ininterrottamente per 16-24 ore all'interno dell'incubatore ad anidride carbonica del microscopio. Utilizza il software ImageJ per compilare tutte le immagini acquisite in un video time-lapse.

Ciò consente l'identificazione delle fasi di fagocitosi dall'internalizzazione delle particelle alla loro completa degradazione. Dopo 24 ore di crescita cellulare in piastre a 96 pozzetti, miscelare accuratamente la sospensione madre di particelle GB. Aggiungere 30 microlitri di sospensione a ciascun pozzetto.

Utilizzare pozzetti senza particelle GB come controlli negativi. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 24 ore per indurre la formazione di vacuolo. Per preparare una soluzione di rosso neutro, sciogliere il rosso neutro per ottenere una soluzione di 0,5 milligrammi per millilitro in DMEM privo di siero.

Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micrometri. Per l'imaging, rimuovere il terreno dalle piastre a 96 pozzetti. Dopo aver aggiunto 60 microlitri di colorante filtrante a ciascun pozzetto, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Lavare i pozzetti tre volte con PBS per rimuovere il colorante in eccesso. Quindi procedere con l'imaging microscopico. Esamina i vacuoli colorati al microscopio utilizzando l'obiettivo 20x per valutare le dimensioni, la morfologia e il numero di vacuoli.

Per preparare la soluzione madre di bafilomicina A1, sciogliere 100 microgrammi del composto in 50 microlitri di dimetilsolfossido. Quindi diluirlo con 950 microlitri di DMEM. Per la soluzione di lavoro, diluire un microlitro del brodo in 1,6 millilitri di DMEM per ottenere una concentrazione finale di 0,1 nanomolari.

Miscelare accuratamente la soluzione di lavoro e aggiungere 100 microlitri ai pozzetti contenenti le cellule nelle piastre a 96 pozzetti. Quindi incubare le cellule in ciascun pozzetto con 30 microlitri di sospensione di particelle GB per studiare l'inibizione della formazione di vacuolo e fagosomi. Per inibire l'acidificazione dei fagosomi, aggiungere 100 microlitri della soluzione di lavoro di bafilomicina A1 a pozzetti con vacuoli preformati precedentemente trattati con GB. Incubare tutti i pozzetti a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 24 ore.

Aggiungere 60 microlitri di colorante rosso neutro a ciascun pozzetto. Incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius e lavare i pozzetti tre volte con PBS per rimuovere il colorante in eccesso, quindi analizzare la formazione di vacuolo e l'acidificazione al microscopio. Trattare le cellule coltivate con 50 microlitri di sospensione GB e incubarle per una notte a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% in condizioni sperimentali standard.

Dopo il trattamento, aggiungere alle cellule una soluzione di arancia acridina a una concentrazione di un milligrammo per millilitro e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius per colorare i vacuoli e gli organelli vescicolari acidi. Successivamente, lavare le cellule tre volte con PBS sterile per rimuovere qualsiasi colorante non legato e ridurre la fluorescenza di fondo. Infine, analizzare immediatamente i vetrini colorati utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo 20x e di un filtro di eccitazione blu da 450 a 492 nanometri.

Valutare la morfologia cellulare e l'assorbimento dell'arancio acridina per comprendere le dinamiche vacuolari. Dopo 30 minuti di trattamento con GB, sono state osservate particelle attaccate alla superficie di tre cellule 3T3-L1. Un'estensione della membrana simile a una coppa è apparsa intorno alla particella indicando l'inizio dell'inghiottimento delle particelle.

A 12 ore dopo il trattamento, all'interno delle cellule sono stati osservati grandi vacuoli legati alla membrana contenenti particelle di GB. L'imaging time-lapse ha dimostrato l'internalizzazione graduale e la formazione di vacuolo in una singola cellula viva nell'arco di 4,75 ore. Le particelle di GB all'interno dei vacuoli si sono progressivamente degradate nel tempo e la cellula ha riacquistato la normale morfologia come indicato dal turnover vacuolare.

L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che le particelle di Godanti Bhasma internalizzate sono state completamente degradate entro 24 ore senza che rimanessero particelle nel terreno di coltura. La colorazione con rosso neutro ha rivelato un'acidificazione del vacuolo significativamente più elevata nelle cellule trattate con GB di tutte e tre le linee cellulari rispetto ai controlli che mostravano solo una debole colorazione lisosomiale. La colorazione arancione con acridina ha mostrato una fluorescenza rosso arancio nei vacuoli delle cellule GB 3T3-L1 che indica acidificazione, mentre le cellule non trattate hanno mostrato solo fluorescenza verde.

Il co-trattamento con bafilomicina ha inibito la formazione di vacuoli sia nelle cellule 3T3-L1 che in quelle HeLa, come evidenziato dall'assenza di vacuoli rispetto ai rispettivi controlli. Dopo il trattamento con bafilomicina, l'assorbimento neutro del rosso è stato efficacemente bloccato, interrompendo l'acidificazione e la maturazione del vacuolo nelle cellule.