Una pipeline di intruglio per la generazione di unità tassonomiche operative molecolari (MOTU) tra coleotteri ripariali e acquatici

Cercando di accelerare la scoperta delle specie nei tropici MEGA diversi, questo protocollo mira a generare ipotesi di raggruppamento delle specie nei coleotteri acquatici e ripariali utilizzando un intruglio di analisi basate su computer.

Questa conduttura di intruglio, che ha utilizzato la sequenza di DNA COI, ha portato a maggiori prove di una delimitazione delle specie per il coleottero zattera del genere Anisostena, che in precedenza era stato eretto solo utilizzando dati morfologici.

Questo protocollo cerca di affrontare l'impedimento tassonomico che la scoperta delle specie attraverso la tassonomia basata sulla morfologia, che è considerata il gold standard nella sistematica degli insetti, è spesso dispendiosa in termini di tempo e fonte di confusione per i coleotteri acquatici poco studiati, ma MEGA diversificati e altamente poco appariscenti.

[Emmanuele] Questa pipeline genera ipotesi molecolari accessorie chiamate MOTU, indipendentemente dal fatto che la sequenza corrisponda alle specie conosciute per le sequenze di riferimento, o che le specie non siano scoperte o non descritte.

Con questo, piuttosto che sezionare e confrontare centinaia di strutture genitali di coleotteri tutte in una volta, la pipeline fornisce un raggruppamento preliminare su cui i campioni possono essere esaminati per la conspecificità.

[Narratore] Per iniziare, avvia MEGA X e carica le sequenze di DNA per l'allineamento. Apri l'interfaccia di allineamento selezionando una linea, quindi facendo clic su modifica o crea allineamento e scegliendo Crea un nuovo allineamento. Fare clic su OK per confermare la selezione e selezionare DNA come tipo di dati. Passa il mouse sulla scheda di modifica. Fare clic su inserisci sequenza da file. Naviga nella directory appropriata e seleziona i file di sequenza da caricare in MEGA. Ora, fai clic su allineamento, quindi seleziona allinea di ClustalW per allineare le sequenze utilizzando le impostazioni predefinite e fai clic su OK per procedere. Per l'editing manuale delle sequenze, eliminare eventuali inserimenti cliccando sulle basi o posizioni inserite e premendo il tasto Canc sulla tastiera. Successivamente, correggi le eliminazioni facendo clic sul trattino che rappresenta una base mancante, rimuovendolo e digitando la base prevista. Quindi, trova la prima posizione in cui tutte le sequenze contengono un carattere. Fare clic sulla casella vuota nell'intestazione della riga immediatamente a sinistra di questa posizione e trascinare per selezionare tutte le posizioni iniziali in eccesso. Premere Elimina per tagliarli. Quindi, trova l'ultima posizione allineata e fai clic sulla casella a destra di questo punto. Premere nuovamente Elimina per tagliare la fine. Ora, seleziona tutte le sequenze e fai clic sulla scheda delle sequenze proteiche tradotte. Quando richiesto, verificare il codice genetico come mitocondriale invertebrato. Se il codice genetico è diverso, fai clic su no e apparirà un menu che ti consentirà di spuntare la casella per il codice genetico mitocondriale degli invertebrati. Se i codoni di stop contrassegnati da asterisco nell'allineamento compaiono su un'intera colonna, fare clic su sequenze di DNA ed eliminare la prima posizione per tutte le sequenze. Ancora una volta, fai clic su Sequenze di DNA, quindi salva l'allineamento in formato .mos o .mosx. Per avviare la delimitazione utilizzando il modulo TaxonDNA, aprire il software TaxonDNA. Fare clic su importa, quindi selezionare FASTA e caricare il file di allineamento in formato FASTA. Ora, fai clic su moduli, quindi seleziona cluster. Impostare il valore di soglia su 3% e selezionare la casella Genera informazioni individuali su ogni cluster. Fare clic su crea cluster ora per avviare il clustering e salvare i risultati facendo uno screenshot. Per la delimitazione utilizzando il metodo Kimura a 2 parametri, apri MEGA e fai clic su file, quindi seleziona Apri un file o una sessione. Fare clic su distanza. Selezionare Calcola distanze a coppie e confermare il file .meg per la delimitazione. Passa il mouse sopra la casella accanto al modello o al metodo e fai clic sulla freccia per espandere il menu a discesa. Selezionare il modello Kimura a 2 parametri e fare clic su OK per eseguire il programma. Aprire la finestra di output dei dati per visualizzare i risultati. Fare clic su file, quindi selezionare l'esportazione e stampare le distanze per salvare il risultato. Aprire le specie di assemblaggio tramite partizionamento automatico o server Web ASAP. Fai clic sulla casella arancione con l'etichetta scegli un file e carica il file .fasta. Scorri verso il basso e fai clic su Vai. Per scaricare il risultato del clustering, fare clic sull'elenco per la riga con il punteggio ASAP più basso e il rango del valore P più alto. Successivamente, per avviare la stima dell'albero, apri MEGA e fai clic sui dati. Quindi selezionare Apri un file o una sessione per caricare il file .meg. Fare clic su modelli, quindi selezionare Trova i migliori modelli di DNA e proteine o ml per determinare il modello di sostituzione più adatto. Fare clic su OK nel menu delle preferenze di analisi. Ora, per generare l'albero, fai clic su filogenesi, quindi seleziona costruisci e testa l'albero della massima verosimiglianza. Utilizza il modello di sostituzione più adatto facendo clic sulla casella accanto al modello o al metodo e selezionando il modello appropriato dal menu a discesa. In test filogenesi, fai clic sulla casella accanto al test di filogenesi, quindi scegli il metodo bootstrap dal menu a discesa. Fare clic sulla casella accanto al numero di repliche bootstrap. Digitare 1.000 e fare clic su OK per eseguire l'analisi. Una volta aperta la finestra contenente l'albero risultante, salvare la sessione come file .mts o .mtsx. Salvate anche l'output come file .newick ed esportate l'albero come immagine .png. Per la delimitazione basata su PTP, visitare il server Web PTP. Clicca su scegli file e carica l'albero in formato Newick. Sotto il mio albero è selezionato rooted. Nella casella sotto i nomi dei taxa dell'outgroup, inserisci l'outgroup digitando il nome della punta del taxon. Successivamente, in soluzione di massima verosimiglianza, fare clic su scarica risultati di delimitazione per salvare l'output PTP ML. Analogamente, in soluzione bayesiana supportata più alta, fare clic su scarica risultati di delimitazione per salvare l'output PTP BI. Per informazioni sulla limitazione basata su MPTP da parte di MPTP, visitare il server Web MPTP. Carica il file Newick trascinandolo sul quadrato grigio o facendo clic sul quadrato. Una volta caricati i dati, fare clic su procedi alla selezione dell'outgroup. Nella pagina delle specifiche dell'outgroup, selezionare l'outgroup facendo clic sulla casella di controllo accanto alle etichette dei taxa degli esemplari dell'outgroup. Quindi, fare clic su selezione modello, selezionare MPTP e fare clic su opzioni di visualizzazione. Nella pagina delle opzioni di visualizzazione, accettare le impostazioni predefinite. Fare clic su Invia. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui file in File scaricabili e scegliere Salva con nome per salvare i risultati. Ora per generare le unità tassonomiche operative molecolari o MOTU, apri l'albero utilizzando un programma di fotoritocco o PowerPoint. Creare una barra per rappresentare i risultati di ciascun approccio di delimitazione delle specie molecolari. Se tutti gli approcci producono risultati identici per un dato cluster molecolare, designare il cluster come MOTU per consenso. Questa figura presenta i risultati dell'albero genico e del clustering molecolare di massima verosimiglianza per i coleotteri borano basati su sequenze COI 3-prime e sei metodi di delimitazione. Tutti i metodi hanno identificato in modo coerente quattro MOTUS, Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini, Byrrhinus A e Byrrhinus B con raggruppamenti identici tra i metodi. Byrrhinus negrosensis e Byrrhinus villarini erano chiaramente separati, nonostante provenissero dalle stesse località. Le sequenze provenienti da quattro province sono state raggruppate in Byrrhinus A, senza mostrare una forte strutturazione geografica. Questa figura mostra il raggruppamento dei coleotteri Anisostena in quattro MOTUS, tra cui Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A e Anisostena B con piena concordanza tra i metodi. Anisostena auxilium si sovrapponeva geograficamente con Anisostena A e Anisostena B, indicando che la geografia da sola non spiegava la divergenza molecolare.