In vivo Imaging dell'attività neurale nelle mosche adulte di Drosophila non anestetizzate

Stiamo cercando di capire le basi molecolari, cellulari e circuitali dell'oblio naturale della memoria, con l'obiettivo di scoprire come il cervello cancella o sopprime attivamente i ricordi per mantenere la flessibilità cognitiva. Recenti ricerche hanno dimostrato che l'oblio non è semplicemente un decadimento passivo dei ricordi, ma piuttosto un processo biologico attivo altamente regolato che richiede specifici modelli di attività neuronale.

Una delle sfide principali consiste nel collegare specifiche manipolazioni circuitali a processi di memoria dinamica, integrando al contempo dati connettomici, genetici e comportamentali in modo rigoroso e interpretabile. Abbiamo contribuito a stabilire che l'oblio è un processo attivo e biologicamente regolato. Il nostro lavoro ha identificato specifici neuroni dopaminergici e percorsi molecolari necessari per la normale dimenticanza nel cervello di Drosophila. Il nostro protocollo consente l'imaging funzionale nei moscerini senza anestesia, prevenendo effetti aspecifici indesiderati da parte degli anestetici. Utilizziamo questo approccio per studiare i correlati neurali alla base della formazione della memoria e dell'oblio attivo della memoria.

[Narratore] Per iniziare, usa gli strumenti Dremel e una lama diamantata per tagliare un tubo metallico ipodermico calibro 22 a una lunghezza di circa 10 centimetri. Con un disco da taglio Dremel 420, lucidare entrambe le estremità del tubo per creare un'apertura liscia e pulita che possa accogliere la proboscide della mosca. Avvolgere il tubo tagliato attorno a una provetta da centrifuga da 15 millilitri per formare la forma curva desiderata. Quindi tagliare un pezzo lungo 7 centimetri di tubo metallico ipodermico calibro 12. Ora usa una lama di rasoio per tagliare l'estremità di un puntale per pipetta da 2 microlitri in modo che si adatti al tubo metallico calibro 22. Inserire il tubo calibro 12 nell'altra estremità del puntale della pipetta. Quindi, mescola insieme una piccola quantità di resina epossidica e indurente. Applicare la resina epossidica alle giunzioni nel punto in cui il piccolo tubo metallico incontra la punta della pipetta e nel punto in cui il tubo più grande si collega all'altra estremità. Lasciare che la resina epossidica si indurisca completamente durante la notte prima di collegare il gruppo a un supporto per micromanipolatore e regolare l'angolo secondo necessità. Per costruire una pipetta per l'erogazione di urti e odori, tagliare 1 millilitro da una pipetta di vetro 1 x 100 al segno di 3 millilitri utilizzando un utensile diamantato Dremel. Quindi taglia una piccola lastra acrilica rettangolare di 24,5 millimetri x 8 millimetri con uno spessore di 1/8 di pollice. Taglia una griglia antiurto in rame per adattarla al pezzo acrilico rettangolare. Saldare due fili elettrici alle estremità opposte della griglia di rame. Ora posiziona la griglia di rame sul pezzo acrilico e piegala leggermente per accogliere l'addome e le zampe della mosca. Utilizzare del nastro isolante per fissare la griglia di rame al pezzo acrilico. Quindi utilizzare una pistola per colla a caldo per fissare la pipetta di vetro alla griglia antiurto, assicurandosi che sia diritta e centrata. Per costruire la camera di registrazione, prendere un vetrino da microscopio in vetro come base della camera. Mescolare insieme resina e colla epossidica. Usando la colla epossidica, attacca i magneti al neodimio su tutti e quattro gli angoli di una camera acrilica nera. Posiziona un magnete aggiuntivo sopra ogni magnete incollato. Quindi incolla i magneti appena posizionati su un vetrino utilizzando la resina epossidica. Tenere il gruppo in posizione con graffette durante l'indurimento. Rimuovere il puntale della pipetta da 200 microlitri dall'aspiratore. Inserire l'aspiratore in una fiala contenente la Drosophila e aspirare una singola mosca nel puntale della pipetta da 1.000 microlitri. Riposizionare il puntale della pipetta da 200 microlitri sull'aspiratore. Quindi soffiare delicatamente e azionare l'aspiratore in modo che la mosca sia immobilizzata a testa in giù nella parte superiore del puntale della pipetta da 200 microlitri. Quindi, posizionare la camera di dissezione sul supporto del manipolatore. Collegare l'aspirapolvere al tubo portamosche e regolare la portata a circa 500 millilitri al minuto. Ora sposta il tubo metallico sottovuoto al centro del campo visivo del microscopio. Aspirare delicatamente la proboscide delle mosche nel supporto del vuoto. Regolare il manipolatore per allineare la testa della mosca con l'apertura della camera. Accendere l'alimentazione a corrente continua. Usando il filo di resistenza al platino, applicare l'acido miristico fuso per incollare gli occhi e il torace alla camera. Una volta fissato, scollegare il tubo del vuoto. Rimuovere la camera di registrazione dal raccordo del vuoto utilizzando il manipolatore e capovolgere la camera. Quindi incolla la proboscide dal basso usando la resistenza al platino. Quando tutto è stato incollato, spegnere l'alimentazione a corrente continua. Quindi capovolgere la camera in posizione verticale. Fissare la camera alla base del vetrino. Taglia un piccolo pezzo di nastro adesivo con le forbici e posizionalo davanti e dietro la testa della mosca. Ruota la camera in modo che la testa della mosca sia rivolta verso lo sperimentatore con un angolo di 90 gradi. Con un ago da dissezione, praticare incisioni verticali lungo i lati degli occhi. Ruotare la camera orizzontalmente. Quindi fai un taglio orizzontale sulla cuticola. Ora aggiungi 100 microlitri di soluzione salina sulla parte superiore della testa della mosca. Usando una pinza affilata, rimuovere la finestra della cuticola, quindi rimuovere il grasso o la trachea rimanenti con la pinza. Posizionare una mosca preparata sul tavolino del microscopio di un microscopio confocale dotato di un laser e di un obiettivo a immersione in acqua. Con un micromanipolatore, regolare la posizione della griglia d'urto e della pipetta degli odori in modo che la mosca sia posizionata correttamente sulla griglia d'urto. Utilizzare la manopola di regolazione della rotta z per eseguire la scansione dell'asse z del cervello e individuare la regione cerebrale di interesse. Impostate le dimensioni del fotogramma su 512 x 512 pixel. Inizia a registrare dal neurone di interesse utilizzando un sistema di erogazione degli odori personalizzato o disponibile in commercio. Impostare la durata della registrazione su 2 minuti. Avviare il protocollo di allenamento utilizzando il sistema di erogazione degli odori 5 minuti dopo aver raccolto le risposte pre-allenamento. Quindi registrare le risposte post-allenamento circa 5-15 minuti dopo l'allenamento. L'indicatore di calcio GCaMP6f e la proteina fluorescente rossa tdTomato sono stati espressi selettivamente nel neurone di output del corpo del fungo con dendriti che si proiettano nei lobi gamma e alfa del corpo del fungo, e il neurone è stato visualizzato utilizzando la linea driver MB077C split-GAL4. Le risposte del calcio nel neurone di uscita del corpo del fungo al 3-ottanolo sono state significativamente ridotte 5 minuti dopo il condizionamento reversivo senza anestesia e sono rimaste soppresse a 15 minuti. Al contrario, le risposte del calcio al 4-metilcicloesanolo sono state significativamente migliorate 5 minuti dopo l'allenamento e sono rimaste elevate a 15 minuti. Le immagini a pseudocolori hanno dimostrato distinti cambiamenti di fluorescenza prima e dopo l'allenamento. Nei moscerini anestetizzati, le risposte del calcio post-allenamento a CS+ erano solo parzialmente ridotte e le risposte a CS- non erano significativamente diverse dal basale. L'analisi quantitativa ha confermato che la risposta CS+ era significativamente depressa dopo l'allenamento nei moscerini anestetizzati, ma le risposte CS- sono rimaste statisticamente invariate. La plasticità era significativamente più alta nei moscerini non anestetizzati rispetto a quelli anestetizzati.