Strumento di imaging epatico riutilizzabile: uno strumento riutilizzabile stampato in 3D per microscopia intravitale epatica

L'obiettivo generale di questa procedura è mettere in mostra lo Strumento di Imaging Epatico Reutilizzabile, o RHIT, come uno strumento rivoluzionario per raccogliere dati biologici dinamici e di alta qualità, specialmente nella ricerca epatica. I metodi scientifici tradizionali per studiare i topi in esperimenti controllati si sono a lungo basati sull'osservazione comportamentale, il monitoraggio fisiologico e l'analisi genetica. La complessità di questi studi spesso porta a output dati incoerenti o limitati.

Molti esperimenti si basano su dati incompleti o difficili da interpretare, come brevi lampi di immagini a bassa risoluzione che svaniscono rapidamente, rendendo difficile catturare tendenze a lungo termine o cambiamenti sottili. Introduciamo il RHIT, che consente una cattura dinamica e ad alta risoluzione per la ricerca sul fegato e oltre. La tecnica che dimostriamo consente la realizzazione di strumenti di imaging personalizzati utilizzando materiali accessibili e tecnologie di stampa 3D ampiamente disponibili.

Progettato per l'uso in ambienti accademici e con risorse limitate, questo approccio consente lo sviluppo e la rapida distribuzione di dispositivi per supportare immagini in vivo ad alta risoluzione. Il nostro Strumento di Imaging Epatico Riutilizzabile, o RHIT, è stato sviluppato per migliorare la stabilità dei tessuti durante la microscopia intravitale del fegato. Il design modulare di RHIT accoglie topi di varie dimensioni e supporta un'imaging estesa dei processi metabolici dinamici con minime interruzioni fisiologiche.

Il RHIT è realizzato in un unico passaggio utilizzando acrilonitrile, butadiene, stirene, ABS, un termoplastico selezionato per la sua leggera pesa, la termostabilità e la durabilità meccanica. Regolando la densità del materiale, il RHIT assorbe efficacemente il movimento causato dalla respirazione e dal battito cardiaco, riducendo così gli artefatti dell'immagine e migliorando la chiarezza. L'inercia chimica e l'insolubilità in acqua dell'ABS garantiscono la disponibilità con i tessuti biologici e consentono una pulizia e un riutilizzo efficienti.

Per ricreare RHIT, usa un software di progettazione prodotto 3D. Per questo design fu utilizzato Autodesk Inventor. Apri Autodesk Inventor e crea una nuova componente standard.

Salva il file con la descrizione appropriata. Crea lo schizzo di RHIT sul piano frontale usando la funzione crea schizzo 2D. Clicca sull'icona rettangolare e posiziona l'angolo in basso a sinistra all'origine del piano dello schizzo.

Disegna un secondo rettangolo all'interno del primo per rappresentare la finestra di imaging di RHIT. Aggiungi le dimensioni a entrambi i rettangoli usando la caratteristica dimensionale, assicurandoti che tutte le lunghezze e larghezze siano riferite all'origine e tra loro. Regola le dimensioni RHIT in base alla dimensione del mouse.

Aggiungi spessore a RHIT selezionando solo il rettangolo esterno e estrussi lo schizzo usando lo strumento di estrusione per lasciare un'apertura al centro. Seleziona la faccia inferiore del RHIT estruso e avvia un nuovo schizzo 2D usando la funzione start 2D sketch. Disegna un rettangolo per definire la tasca del cuscinetto riscaldante.

Definisci le dimensioni del rettangolo in base alla dimensione e allo spessore della cuscinetta termica che verrà inserita in questa fessura. Queste misurazioni dovrebbero corrispondere al cuscinetto termico fisico da utilizzare per garantire una modellazione accurata della temperatura del mammifero. Applica le dimensioni richieste usando la caratteristica dimensionale.

Esci dallo schizzo 2D ed esegui una rimozione del materiale usando lo strumento di estrusione tagliata per creare una cavità profonda per il pad riscaldante. Zooma quando serve per posizionare con precisione lo schizzo. Inizia un nuovo schizzo per la sonda di temperatura sulla stessa faccia della cavità.

Clicca su inizia uno schizzo 2D e seleziona l'icona del cerchio. Posiziona il cerchio sulla superficie piana e dimensiona di conseguenza. Esci dalla modalità schizzo.

Clicca su estrusione e seleziona lo schizzo del cerchio. In modalità estrusione, clicca su tagli, estrussi e rimuovi materiale. Posiziona il cerchio sul lato destro della faccia con l'inserto tasca.

Non deve ancora essere centrato. Aggiungi le dimensioni per allinearlo con il centro dello spessore del RHIT. Clicca su estruso.

Apparirà un pop-up con una freccia che indica la direzione del taglio, insieme all'opzione attraversare tutto. Seleziona attraverso tutti per tagliare tutto il materiale, poi clicca ok. Modalità estrusione di uscita.

Aggiungi fillet ai bordi della finestra cliccando sull'icona del fillet e seleziona tutti e otto i bordi netti. Aggiungi la dimensione del fillet e esci dalla modalità fillet. Prepara il modello per la stampa 3D navigando nella scheda ambiente e selezionando la scheda Stampa 3D.

Per stampare il RHIT non modificato, importa il file STL, sia dalla figura 1A che dai materiali supplementari, nel software di preparazione della stampa 3D A. Clicca su importa, seleziona il file e clicca su prepara per tagliare il modello in livelli stampabili. Scegli una stampante 3D commerciale compatibile e clicca su stampa.

Monitora il processo di stampa. Una volta completato, rimuovi e pulisci con cura il RHIT stampato secondo necessità. Aspetta 10-15 minuti dopo le espulsioni prima di iniziare l'intervento chirurgico e l'immagini.

Preparazione al microscopio e utilizzo di RHIT. Preparare un microscopio confocale rovesciato convenzionale per IBN epatico, come mostrato nella figura 2A. Inserisci l'adattatore per lo stadio per adattare il campione.

Per questo protocollo, veniva utilizzato un inserto metallico su misura con un'apertura circolare da 35 millimetri e un vetro da copertura da 40 millimetri. Pulisci accuratamente entrambi i lati del vetro di copertura prima e dopo l'immagini, usando il 70% di etanolo se necessario. Fissare il RHIT appropriato in base alla dimensione del mouse con del nastro adesivo allineando l'apertura RHIT con l'obiettivo obiettivo, parallelo al scorrimento di copertura per immagini, come mostrato nella figura 2G, sull'inserto metallico con nastro sopra il vetro di copertura.

Seleziona l'obiettivo per l'imaging in base alla dimensione dell'area, alla risoluzione spaziale e al tempo di immagini, ad esempio un obiettivo d'acqua 25X ogni 95. Uniforma l'obiettivo vicino al vetro di copertura. Fissa una striscia di garza sulla finestra bagnata con del nastro adesivo.

Questo aiuterà a posizionare il tessuto e a separarlo dagli altri organi addominali. Preriscalda la RHIT usando un cuscinetto caldo inserito nella fessura e fissa la sonda termica adiacente alla RHIT, come mostrato nella figura da 2G fino all'H. Questo manterrà la temperatura corporea del mouse durante l'imaging. Rasi il mantello addominale usando un tagliacapelli e/o una crema depilatoria.

Rimuovere i residui di capelli e disinfettare la pelle esposta con il 70% di etanolo. A seconda dei requisiti istituzionali dell'IACUC, può essere utilizzato un detersione alternata di Betadine ed etanolo per garantire una preparazione adeguata del sito chirurgico. Rivaluta la profondità dell'anestesia prima dell'intervento chirurgico sull'animale.

Espone il fegato realizzando un'incisione orizzontale a forma di mezzaluna di due o tre centimetri sotto la gabbia toracica con forbici chirurgiche dal xifoide, terminando sul lato laterale sinistro della parte superiore dell'addome. Dopo l'incisione iniziale, si effettua con attenzione una piccola incisione secondaria nello strato muscolare per esporre il lobo sinistro del fegato. Cauterizza se necessario per evitare sanguinamento.

Prevenire danni da calore al fegato durante l'uso del cauterizzatore posizionando una garza imbevuta di soluzione salina tra il fegato e lo strato muscolare per assorbire il calore emanato dal muscolo. Evita qualsiasi sanguinamento eccessivo, traumi chirurgici o meccanici, o compressione esterna. Una volta esposto il fegato, trasferire il topo allo stadio del microscopio.

Posizionamento del topo sul palco del microscopio. Posiziona l'addome del topo anestetizzato rivolto verso il basso sopra la piattaforma RHIT del microscopio. Regola il cono nasale in modo che il topo rimanga sotto anestesia.

Usa un applicatore con punta di cotone imbevuto di soluzione salina per guidare delicatamente il lobo laterale sinistro del fegato contro il sottovoglio di copertura, applicando delicatamente una pressione esterna sulla cavità toracica. Approfitta della gravità per manovrare con attenzione il fegato fuori e sul vetro di copertura. Usa una striscia di garza per separare delicatamente il fegato dal corpo del topo.

Controlla nuovamente il cono nasale per assicurarsi che il topo rimanga sotto anestesia durante l'immagini. Prevenire la disidratazione dei tessuti applicando un gel a base d'acqua ai bordi della cavità esposta ed evitando il contatto diretto con la borsa termica. Un microscopio con una camera di umidità chiusa può anche aiutare a mantenere temperatura e umidità.

Applica una pomata optalmica sugli occhi per prevenire la secchezza corneale. Infine, imposta una IVM in timelapse per iniziare l'imaging (imaging). Apri gli otturatori laser, valuta la marcatura fluorescente e individua una regione stabile di interesse con un flusso sanguigno significativo.

Seleziona le acquisizioni di immagine appropriate, inclusi formato, velocità, intervalli di immagine e durata del tempo, media del fotogramma, ecc. Definire i limiti superiore e inferiore per gli Z-stack se necessario, e avviare la registrazione in timelapse. Per validare il nostro protocollo, abbiamo quantificato la stabilità dell'immagine utilizzando l'indice di similarità strutturale, o SIM, mostrato nella figura 3D.

SIM confronta due immagini basandosi su luminanza, contrasto e pattern strutturali. Un valore di uno indica somiglianza totale, mentre zero riflette distorsione. La Figura 3C mostra che RHIT produce costantemente i valori SIM più alti, fino a 50 volte superiori rispetto a nessun inserto, dimostrando una qualità dell'immagine superiore.

Nelle immagini etichettate da A a C, abbiamo confrontato la IVM epatica senza stabilizzante, con il cartone inserito, e con la RHIT. La RHIT mantiene una risoluzione chiara delle gocce lipidiche nel magenta, dei nuclei nel verde e del vascolare nel ciano. Gli inserti in bianco e nero evidenziano la stabilità dell'immagine.

RHIT ha inoltre permesso l'IBM a lungo termine nei topi obesi per oltre otto ore, come mostrato nel primo film. Insieme, questi risultati hanno confermato che RHIT migliora significativamente la qualità dell'imaging e la riproducibilità in diverse condizioni. Nel complesso, RHIT semplifica la complessità tradizionalmente richiesta per l'IBM epatico, migliorando sia la riproducibilità che l'accessibilità.

Questo approccio prevede un movimento più ampio verso l'utilizzo della stampa 3D per la standardizzazione di protocolli di imaging avanzati. Oltre all'imaging epatico, i principi progettuali di RHIT possono essere estesi ad altre applicazioni, tra cui la tomografia d'organi, la scienza dei materiali e l'ingegneria, dove la stabilità del movimento è fondamentale per la fedeltà dell'immagine.