Name: Utilizzo del metodo di trasferimento delle goccioline per preparare in modo affidabile vescicole unilamellari giganti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri il metodo di trasferimento delle goccioline per preparare vescicole unilamellari giganti con alta efficienza di incapsulamento. Questo protocollo accessibile apre nuove strade per la biologia sintetica e la microrobotica.

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Implementando una tecnica precedentemente descritta per produrre liposomi1, Pautot et al. hanno stabilito un protocollo per produrre vescicole lipidiche con diametri compresi tra 0,1 e 1 μm di diametro2. Il metodo di trasferimento delle gocce si è rapidamente dimostrato efficace nella produzione di vescicole ancora più grandi (diametri superiori a 1 μm)3, guadagnando sempre più popolarità per la semplicità di esecuzione e l'elevata efficienza di incapsulamento. Infatti, rispetto ai metodi di rigonfiamento (come il rigonfiamento del gel o l'elettroformazione), questo protocollo riduce il volume di soluzione di carico necessario per formare un numero comparabile di vescicole e i rifiuti associati4. I GUV possono essere assemblati da interfacce fluide attraverso metodi alternativi con un'efficienza di incapsulamento comparabile. Tuttavia, rispetto a quelli basati su chip microfluidici 5,6 o incapsulamento continuo dell'interfaccia di goccia (cDICE)7, il trasferimento di gocce offre la configurazione più semplice accessibile in qualsiasi laboratorio con apparecchiature di base. Inoltre, i metodi microfluidici possono portare a GUV con inclusioni di olio indesiderate nella membrana. Per questi motivi, il trasferimento di goccioline è stato il metodo di scelta per caricare i GUV con carichi di valore nei campi delle celle artificiali 3,8,9,10 e, recentemente, della microrobotica 11,12.
Il metodo si basa sulla formazione di lembi di membrane attraverso la stabilizzazione delle interfacce acqua/olio mediate dai fosfolipidi. In primo luogo, i fosfolipidi vengono disciolti in un olio (soluzione lipidica, LS), quindi viene preparata un'emulsione acqua-in-olio con la soluzione acquosa contenente il carico GUV desiderato (soluzione interna, IS) nel LS oleoso. L'emulsione viene quindi trasferita in un tubo dove un'altra soluzione acquosa (denominata soluzione esterna, OS) è stata precedentemente bilanciata con LS per formare un'interfaccia acqua-olio. I GUV si formano quando le goccioline d'acqua sono costrette ad attraversare questa interfaccia OS/LS mediante centrifugazione: il lembo interno dei GUV si forma sulla superficie delle goccioline IS, mentre il lembo esterno si forma tra OS e LS (Figura 1).
Sono state descritte molte varianti di protocollo con parametri aggiustati in base alle esigenze sperimentali contingenti. Un primo tentativo esteso di ottimizzare il processo è stato descritto da Moga et al.13, mentre Zhang et al. ha raccolto la maggior parte degli esempi rilevanti in una recente revisione14. Nonostante i numerosi parametri descritti che influenzano il protocollo, non vi è alcuna indicazione su come potrebbe essere condotto un processo di ottimizzazione per una nuova formulazione di GUV, né le migliori pratiche per il recupero e la manipolazione dei GUV dopo la produzione. Sulla base della letteratura scientifica disponibile e della nostra esperienza diretta, forniamo qui un protocollo generale per produrre GUV discutendo i principi di base. Così facendo, forniamo indicazioni utili per l'ottimizzazione di nuove formulazioni di GUV e due accorgimenti sempre applicabili al protocollo: la preparazione di LS in ambiente controllato e un metodo per rimuovere facilmente la fase oleosa superiore per il recupero di un campione di GUV pulito. Abbiamo scelto due esempi: uno con 240 mM di saccarosio come IS e 0,2 mM di DOPC in olio siliconico AR20 come LS (condizione E [vuoto], vedi Tabella 1) e l'altro composto da 0,2% di microparticelle di polistirene da 1,1 μm in 240 mM di saccarosio come IS e 3,18 mM di DOPC in olio minerale come LS (condizione P [con particelle], vedi Tabella 1). Entrambi i campioni sono stati prodotti con 240 mM di glucosio come OS. Abbiamo scelto questa osmolarità per ottenere GUV che, in condizioni fisiologiche, hanno una membrana lipidica rilassata (bassa tensione di membrana).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Rappresentazione schematica del metodo di trasferimento delle goccioline. (A) Tre soluzioni vengono preparate in fiale separate: fosfolipidi in olio (fase gialla) per formare una soluzione lipidica, una soluzione contenente saccarosio (in ciano) come soluzione interna e una soluzione equiosmolare di glucosio (bianca) come soluzione esterna. (B) LS viene quindi miscelato con l'IS per formare un'emulsione stabile, quindi (C) un'interfaccia tra OS e LS viene lasciata equilibrare prima che (D) l'emulsione venga versata sopra di essa. (E) Le goccioline d'acqua sono costrette ad attraversare l'interfaccia LS/OS mediante forza centrifuga per (F) consentire la formazione di GUV. La figura non è in scala e ha lo scopo di fornire solo uno schema del metodo. Abbreviazioni: LS = soluzione lipidica; IS = soluzione interna; OS = soluzione esterna; GUV = vescicola unilamellare gigante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m membrana mista esteri di cellulosa&nbsp; filtri per siringhe</td><td>Merck</td><td>SLGSVR255F</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>Bioclasse</td><td>06.0279.00</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L. siringa di vetro</td><td>Merck</td><td>20737</td><td></td></tr><tr><td>Becher da 150 mL</td><td>Avantor</td><td>213-1123</td><td>Almeno 3</td></tr><tr><td>Fiale di vetro scuro da 20 mL ND24</td><td>Avantor</td><td>548-9001A</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 2 mL</td><td>Bioclasse</td><td>07.3534.99</td><td></td></tr><tr><td>Bombola da 50 mL</td><td>Avantor</td><td>612-3843</td><td></td></tr><tr><td>500 &mu; L. siringa di vetro</td><td>Hamilton</td><td>549-1166</td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 50 mL</td><td>Merck</td><td>CLS352070</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 50 ml&nbsp;</td><td>Fisher Scientifico</td><td>8SS50L1</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 5 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>622201</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere da 600 mL</td><td>Avantor</td><td>213-1126</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; Pallone Chner</td><td>Merck</td><td>Z740682</td><td></td></tr><tr><td>Anelli in sughero per fiaschi a fondo tondo</td><td>Avantor</td><td>217-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cristallizzatore</td><td>Dutscher</td><td>Codice 080474A</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Termoigrometro digitale</td><td>Bohlender</td><td>V1863-07</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Research</td><td>Codice 850375C</td><td></td></tr><tr><td>Trapano</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Sale disodico erioglaucina (Blu brillante FCF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa G18</td><td>Terumo</td><td>AN1838R1</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa G21</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td></td></tr><tr><td>Camera portaoggetti</td><td>Bel-Art</td><td>F50030-0000</td><td>Se disponibile, è possibile utilizzare una scatola a guanti, ma nei laboratori con bassi livelli di umidità potrebbe non essere necessaria</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico a piastra riscaldante</td><td>Articoli da laboratorio LLG</td><td>6.263 448</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale leggero</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330779</td><td></td></tr><tr><td>Nuove coccine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199737</td><td></td></tr><tr><td>O-ring in gomma nitrile, O-ring, foro da 8 mm, diametro esterno 12 mm</td><td>RS</td><td>196-4863</td><td></td></tr><tr><td>Tappi a vite aperti con setto ND24</td><td>Avantor</td><td>548-0031A</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta P1000</td><td>Fisher Scientifico</td><td>12346132</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta P10000</td><td>Avantor</td><td>89079-978</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta P200</td><td>Fisher Scientifico</td><td>12326132</td><td></td></tr><tr><td>Asciugamani di carta</td><td>Avantor</td><td>KIMB6657</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Avantor</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (1000)</td><td>Eppendorf</td><td>0030000919</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (10000)</td><td>Eppendorf</td><td>0030000765</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (200)</td><td>Eppendorf</td><td>0030000870</td><td></td></tr><tr><td>Particelle di polistirene, 1,1 & micro; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LB11-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tappo in gomma</td><td>Bioclass S.r.l.</td><td>12.2300.05</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione conica in gomma</td><td>Avantor</td><td>217-0211</td><td></td></tr><tr><td>Tappi a vite&nbsp; ND24</td><td>Avantor</td><td>548-0161A</td><td></td></tr><tr><td>Olio siliconico AR20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in silicone (diametro interno 1,6 mm, diametro esterno 3 mm)</td><td>RS</td><td>667-8441</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in silicone (diametro interno 6 mm, diametro esterno 12 mm)</td><td>RS</td><td>273-2541</td><td>Almeno 6 m</td></tr><tr><td>Giunzione a tre vie</td><td>RS</td><td>795-405</td><td></td></tr><tr><td>Giunzione a due vie</td><td>RS</td><td>419-7287</td><td></td></tr><tr><td>Valvola a due vie</td><td>Claber</td><td>91280</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22934</td><td>Quando disponibile, questo prodotto può essere sostituito con acqua purificata attraverso i sistemi Milli-Q</td></tr><tr><td>Forbici universali</td><td>Bochem</td><td>4154</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzo del metodo di trasferimento delle goccioline per preparare in modo affidabile vescicole unilamellari giganti

Using the Droplet Transfer Method to Reliably Prepare Giant Unilamellar Vesicles

Una preparazione ottimale di GUV è caratterizzata dalla formazione di una fase oleosa limpida e di un pellet distinto (Figura 4A). Nei casi in cui le goccioline d'acqua non riescono a convertirsi in GUV, in genere collassano e lasciano detriti fosfolipidi all'interfaccia OS/LS (Figura 4C). Questo effetto è molto probabilmente causato dall'aggregazione di fosfolipidi e altre molecole dalla fase oleosa, risultante da un insufficiente equilibrio dei fosfolipidi all'interfaccia acqua/olio. Tuttavia, nonostante l'assenza di un pellet visibile o la presenza di detriti all'interfaccia, i GUV possono ancora formarsi, consentendo al processo di continuare. Sebbene le fasi di lavaggio non siano del tutto efficaci nella rimozione di tutti i detriti fosfolipidici, aiutano in modo significativo nell'eliminazione delle goccioline d'olio, migliorando la qualità complessiva del campione (confrontare la Figura 6A e la Figura 6B).
L'uso di vecchi LS o LS preparati in condizioni di elevata umidità spesso si traduce in una riduzione delle dispersioni di GUV con una resa inferiore e un contenuto più elevato di aggregati disordinati che sono molto probabilmente formati da fosfolipidi e altre molecole dalla fase oleosa (Figura 6C). Per i LS preparati in condizioni di elevata umidità, abbiamo osservato coefficienti di variazione superiori a 0,8 nella produzione di GUV (con campioni contenenti pochissimi GUV), mentre per i LS preparati nella camera a guanti modificata, il coefficiente di variazione era inferiore a 0,5.
Diverse condizioni di centrifugazione possono influire sulla resa e sulla qualità del GUV. Da un'analisi qualitativa, 20 minuti a 3.300 ×g sono stati identificati come una buona condizione per i GUV caricati con saccarosio (campione E). L'abbassamento della velocità (45 min a 500 × g) ha comportato una resa ridotta, mentre un aumento (5 min a 16.600 × g) ha portato a una maggiore formazione di aggregati fosfolipidici disordinati. Una forza centrifuga debole può impedire a molte goccioline di attraversare l'interfaccia OS/LS, da qui la resa ridotta, mentre una forza forte può non fornire tempo sufficiente per l'organizzazione dei fosfolipidi sul lembo esterno durante l'attraversamento dell'interfaccia (Figura 7). L'incapsulamento delle microparticelle può anche essere ottimizzato con regolazioni dei parametri di centrifugazione, a condizione che la densità di massa delle microparticelle corrisponda approssimativamente a quella dell'IS. A questo scopo, l'abbassamento dell'accelerazione di centrifugazione (e a sua volta l'aumento del tempo di centrifugazione) consente un incapsulamento più omogeneo delle particelle, evitando la rottura della membrana fosfolipidica dovuta alla forza esercitata dalle particelle solide (un esempio di buon incapsulamento è mostrato nella Figura 6D mentre lo studio dei parametri ottimali di centrifugazione è ancora in corso17).
Poiché la diffusione dei fosfolipidi può essere influenzata dalla fase oleosa, è possibile eseguire un semplice test qualitativo per valutare la stabilità dell'emulsione (Figura 5). Con l'aiuto di un colorante colorante (Brilliant Blue FCF) disciolto nell'IS per migliorare la visualizzazione, è possibile preparare e osservare nel tempo emulsioni con diversi rapporti acqua/olio. La perdita di stabilità può essere visualizzata dall'aggregazione di goccioline d'acqua e dalla conseguente separazione dalla fase oleosa. Poiché le goccioline di grandi dimensioni (visibili ad occhio nudo) hanno meno probabilità di essere convertite in GUV, si consiglia di utilizzare la condizione di emulsione che fornisce la minima separazione di fase.
L'effetto delle variazioni nel protocollo può essere verificato attraverso un'analisi della distribuzione dimensionale come descritto nella sezione 4 del protocollo: i diametri dei GUV possono essere misurati utilizzando ImageJ da immagini al microscopio a contrasto di fase e la distribuzione dimensionale può essere analizzata con uno script disponibile su GitHub16. Seguendo questo protocollo, è stato possibile, ad esempio, osservare un aumento dei GUV con diametri maggiori quando si sceglie l'olio minerale rispetto all'olio siliconico AR20 (Figura 8).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig2v5.jpg"> 
Figura 2: Configurazione della camera del guanti. Questa figura mostra le principali modifiche alla camera a guanti per la preparazione della soluzione lipidica. (A) Collegamento di ingresso con azoto e vuoto; (B) raccordo di ingresso con la camera del guanti; (C) valvola di uscita; (D) cappuccio porta-aghi per l'evaporazione del solvente; (E) tubi sottili per l'evaporazione del solvente; (F) particelle di silice per assorbire l'umidità; (G) articoli da inserire nella camera del guanti: termoigrometro digitale (1), soluzione lipidica in solvente organico (2), supporto per anello di sughero (3), siringa di vetro (4), tappo aperto con setto e aghi (5), soluzione oleosa (6), flaconcino scuro aperto con tappo (7), puntali da 10 mL (8), pipetta P10000 (9); (H) estremità del tubo di scarico immersa nell'acqua; (I) flaconcino chiuso con tappo porta-aghi collegato all'ingresso e all'uscita; (J) schemi della camera del vano portaoggetti modificata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig3v5.jpg"> 
Figura 3: Contenitore per una facile rimozione dell'olio. Fasi principali della preparazione dei GUV in un contenitore per una facile rimozione dell'olio come da protocollo sezione 2.1. (A) Viene praticato un foro in un tappo della provetta da 5 ml per consentire l'inserimento di un puntale P1000; quindi (B) il tappo viene posizionato su una provetta vuota da 5 mL con la punta inserita nel foro attraverso un O-ring. (C) Le soluzioni vengono inserite nella provetta secondo le sezioni 2.2 e 2.3 del protocollo, la punta viene tappata e la provetta viene inserita all'interno di una provetta da 50 mL. I GUV preparati da 0,2 mM di DOPC in olio di silicone sono stati caricati con 230,7 mM di saccarosio e 3,1 mM di FCF blu brillante per migliorare la visualizzazione. (D) Dopo la centrifugazione, la fase oleosa superiore viene intrappolata all'interno della punta insieme a una parte del tampone GUV (che appare ciano a causa della mancata conversione di parte delle goccioline in GUV e del rilascio del colorante nell'OS). Grazie al tappo in gomma, il puntale può essere facilmente rimosso dalla provetta da 5 mL insieme al contenuto liquido, consentendo così una rapida e facile rimozione di tutta la fase oleosa. (E) Il pellet GUV può essere facilmente raccolto dal fondo di una provetta in una dispersione chiara, senza apparente contaminazione da olio, come verificato (F) mediante microscopia a contrasto di fase. Barra della scala = 20 μm. Abbreviazioni: LS = soluzione lipidica; IS = soluzione interna; OS = soluzione esterna; GUV = vescicola unilamellare gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig4v5.jpg"> 
Figura 4: Formazione di GUV. Esempi di (A) interfaccia OS/LS, (B) un pellet GUV pulito con una fase oleosa limpida e (C) un pellet GUV con detriti all'interfaccia OS/LS (i detriti e il pellet appaiono rossastri perché l'IS di questa popolazione GUV è stato integrato con 1,65 mM di colorante New Coccine per migliorare la visualizzazione). Abbreviazioni: LS = soluzione lipidica; IS = soluzione interna; OS = soluzione esterna; GUV = vescicola unilamellare gigante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig6v5.jpg"> 
Figura 5: Stabilità dell'emulsione con diversi rapporti olio e acqua-in-olio. La figura mostra la stabilità delle emulsioni nel tempo, a seconda del tipo di olio e del rapporto acqua/olio (s/p) utilizzato. L'IS era composto da 230,7 mM di saccarosio e 3,1 mM di FCF blu brillante per migliorare la visualizzazione delle emulsioni. Le emulsioni preparate con olio minerale sono meno stabili delle loro controparti realizzate con olio siliconico AR20. Questo effetto è ulteriormente amplificato con l'aumentare dei rapporti w/o. Sebbene le emulsioni nell'olio siliconico AR20 siano significativamente più stabili, la loro stabilità diminuisce anche all'aumentare del rapporto w/o, con separazione di fase visibile immediatamente dopo l'emulsione (olio siliconico AR20 al 10%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig5v5.jpg"> 
Figura 6: Osservazione dei GUV con un microscopio a contrasto di fase. Un ingrandimento 20x di GUV caricati con saccarosio preparato da un LS composto da 3,18 mM di DOPC in olio minerale. (A) campione recuperato dopo la rimozione dell'olio; (B) campione recuperato dopo le fasi di lavaggio; (C) scarsa resa GUV ottenuta da un LS preparato in ambienti con ossigeno e umidità non regolati; (D) GUV caricati con microparticelle. Barra di scala = 10 μm; Le gocce di olio sono cerchiate e gli esempi di aggregati disordinati di fosfolipidi e molecole di olio sono indicati da una freccia. Abbreviazioni: LS = soluzione lipidica; GUVs = vescicole unilamellari giganti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig7v5.jpg"> 
Figura 7: Effetto di diverse condizioni di centrifugazione sulla formazione di GUV. Immagini a contrasto di fase di GUV caricati con saccarosio preparati con un LS composto da 0,2 mM di DOPC in olio di silicone AR20. La figura mostra un confronto qualitativo dei GUV a (A) 16.600 × g per 5 minuti, (B) 3.300 × g per 20 minuti e (C) 500 × g per 45 minuti. Mentre l'elevata velocità di centrifugazione si traduce in una maggiore presenza di aggregati fosfolipidi, una bassa velocità di centrifugazione porta a una resa ridotta. Barra di scala = 50 μm. Abbreviazioni: LS = soluzione lipidica; GUV = vescicola unilamellare gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig8v5.jpg"> 
Figura 8: Analisi della distribuzione dimensionale. Confronto di due campioni di GUV caricati con saccarosio ottenuti da (A) 0,2 mM di DOPC in olio minerale e (B) 0,2 mM di DOPC in olio di silicone AR20 (*il campione è stato diluito 10 volte per consentire una chiara distinzione dei GUV al microscopio a contrasto di fase). L'analisi effettuata seguendo la sezione 4 del protocollo mostra una distribuzione dimensionale spostata verso diametri più elevati per il campione di olio minerale rispetto ai campioni di olio siliconico AR20. Tuttavia, la resa del campione di silicone è quasi 20 volte superiore. Abbreviazioni: GUV = vescicola unilamellare gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Passo</td>
			<td>Condizione E</td>
			<td>Condizione P</td>
			<td>Descrizione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.1</td>
			<td>4,11 grammi</td>
			<td>17,11 g</td>
			<td>Massa di saccarosio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.1</td>
			<td>2,16 g</td>
			<td>2,16 g</td>
			<td>Massa di glucosio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.2</td>
			<td>240 mM</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>Concentrazione di saccarosio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.2</td>
			<td>240 mM</td>
			<td>240 mM</td>
			<td>Concentrazione di glucosio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.2</td>
			<td>Olio siliconico</td>
			<td>Olio minerale</td>
			<td>Fase oleosa per LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.2</td>
			<td>Siringa di vetro da 0,1 mL</td>
			<td>Siringa di vetro da 0,5 mL</td>
			<td>Siringa in vetro per il trasferimento di DOPC in soluzioni di cloroformio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.10</td>
			<td>63 μl</td>
			<td>500 μl</td>
			<td>Volume di DOPC in soluzione di cloroformio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.16</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>Volume dell'olio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4.1</td>
			<td>3300 g 20 minuti</td>
			<td>500 g 45 minuti</td>
			<td>Condizione di centrifugazione</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Variazioni nel protocollo. La tabella riporta le variazioni per i vari passaggi del protocollo (indicati nella prima colonna) per preparare due diverse popolazioni di GUV: GUV caricati con saccarosio (condizione E) e GUV caricati con microparticelle (condizione P).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ID</td>
			<td>Passaggi coinvolti</td>
			<td>Diametro interno (mm)</td>
			<td>Diametro esterno (mm)</td>
			<td>Lunghezza (mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1.2.1; 1.2.3</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.3.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.3.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.2.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>1.2.1; 1.2.6; 1.3.13</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>1.2.2; 1.2.7; 1.3.11</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>1.2.2; 1.2.7; 1.3.11</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>1.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.15</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>1.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.15</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Tubi per i collegamenti del gas e del vuoto nella camera del guanti. La tabella riporta le dimensioni dei tubi in silicone utilizzati per collegare la camera del vano portaoggetti alle linee di azoto e vuoto. Gli ID di riferimento vengono forniti per facilitare il processo di assemblaggio.

Utilizzo del metodo di trasferimento delle goccioline per preparare in modo affidabile vescicole unilamellari giganti

Over the past two decades, the droplet transfer method, also known as inverted emulsion, double emulsion, phase transfer, or emulsion transfer, has proven ...

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