Utilizzo del metodo di trasferimento delle goccioline per preparare in modo affidabile vescicole unilamellari giganti

Puntiamo a microrobot simili a cellule che navigano attraverso i tessuti del corpo per somministrare terapie localmente. Si basano su vescicole unilamellari giganti e una membrana fosfolipidica e contengono particelle attive. Questo protocollo offre una guida per i principianti che desiderano adottare e adattare il metodo di trasferimento delle goccioline nella biologia sintetica e in altri campi, ad esempio nella microrobotica.

Rispetto ad altre tecniche di preparazione GUV, questo protocollo offre un'elevata efficienza di incapsulamento e un'esecuzione semplice, che lo rende accessibile a qualsiasi gruppo di ricerca con attrezzature di laboratorio di base. Valuteremo la navigazione dei microrobot basati su GUV in ambienti simili ai tessuti e implementeremo strategie di rilevamento per consentire il movimento autonomo verso le cellule malate. Per iniziare, spostare la camera del vano portaoggetti all'interno o accanto a un cappuccio chimico.

Aprire la camera del vano portaoggetti e posizionare un cristallizzatore riempito con particelle di silice sul fondo della camera. Copri il cristallizzatore con una superficie di supporto bianca, quindi sovrapponilo con carta assorbente. Inserire tutti i materiali necessari nella camera del guanto e posizionare la fiala di vetro contenente la soluzione di cloroformio su un supporto per anello di sughero o un becher da 150 millilitri posizionato il più vicino possibile al lato dell'operatore.

Ora, chiudi la camera del guaglio, assicurandoti che le due metà siano allineate saldamente e non possano scivolare. Utilizzare le viti di plastica fornite per sigillare completamente la camera. Chiudere la valvola di scarico e immergere il tubo numero cinque in un becher da 500 millilitri riempito per metà d'acqua.

Quindi, collegare l'estremità del tubo numero due regolata dalla valvola alla linea del vuoto. Quindi, collegare l'altra estremità alla linea dell'azoto utilizzando il tubo numero tre. Aprire la valvola e accendere la linea del vuoto fino a quando i guanti non si gonfiano e diventano troppo rigidi per piegarsi.

Quindi, chiudere sia la linea del vuoto che la valvola. Quindi, apri la linea dell'azoto fino a quando i guanti non si sgonfiano e si estendono dalla camera del guanti. Dopo aver indossato i guanti, utilizzare una siringa di Hamilton per trasferire il volume specificato di DOPC in soluzione di cloroformio in un flaconcino di vetro scuro.

Sigillare il flaconcino con il tappo contenente gli aghi. A questo punto, collegare il tubo numero sei al tubo numero otto e il tubo numero sette al tubo numero nove utilizzando le giunzioni a due vie. Rimuovere i guanti dalla camera del vano portaoggetti e aprire la valvola di uscita.

Quindi, aprire lentamente la linea dell'azoto e monitorare il flusso di gas per verificare la presenza di bolle nel becher. Aumentare gradualmente il flusso di azoto fino a raggiungere una velocità di gorgogliamento costante ma osservabile. Dopo tre minuti di flusso, chiudere la linea dell'azoto.

Una volta che l'ultima bolla esce dal becher, chiudere la valvola di uscita. Rimettere i guanti e scollegare i tubi otto e nove dalle giunzioni a due vie. Quindi, aprire la fiala e riportare il tappo nel tubo da 50 millilitri.

Quindi aprire il flacone dell'olio e trasferire la quantità necessaria di olio nella fiala scura. Sigillare nuovamente la fiala con il tappo, rimuovere i guanti e aprire la camera del guanti. Agitare energicamente il flaconcino di sospensione lipidica sigillata per almeno 30 secondi.

Quindi incubarlo a 80 gradi Celsius a bagnomaria per 30 minuti. Dopo aver agitato nuovamente la fiala, incubarla per una notte a temperatura ambiente. Usando le forbici, taglia il tappo da un tubo da cinque millilitri.

Praticare un foro di circa otto millimetri al centro del tappo per inserire un puntale per pipetta P1000. Se il foro è troppo largo per adattarsi alla punta, scartare il tappo e ricominciare con uno nuovo. Con una striscia di carta vetrata di due x cinque centimetri, liscia i bordi del foro praticato.

Riposizionare il tappo sulla provetta da cinque millilitri e centrifugare a 3.000 g per cinque minuti per eliminare eventuali particelle di plastica residue. Quindi, rimuovere il tappo e gettare il tubo. A questo punto, tagliate il tappo da un nuovo tubo da cinque millilitri e sostituitelo con il tappo forato preparato.

Inserire una punta P1000 attraverso il foro con un O-ring bloccato tra la punta e il cappuccio per evitare ulteriori movimenti verso il basso. Riempire il tubo con 5,5 millilitri di soluzione esterna attraverso la punta. Agitare il flaconcino di sospensione lipidica preparato in precedenza per almeno 30 secondi.

Quindi, incubarlo nel bagnomaria a 50 gradi Celsius per 30 minuti. Lasciare equilibrare le soluzioni acquose preparate in precedenza a temperatura ambiente per almeno 10 minuti. Ora, pipettare 300 microlitri di soluzione esterna in una provetta da 1,5 millilitri o nella provetta da cinque millilitri precedentemente modificata.

Sovrapporre lentamente 100 microlitri di sospensione lipidica sopra la soluzione oleosa, garantendo la formazione di due fasi distinte e continue. Lasciare riposare l'interfaccia indisturbata per 10 minuti per equilibrarsi. In una provetta da due millilitri, pipettare 250 microlitri di sospensione lipidica, seguiti da 6,25 microlitri di soluzione interna per preparare un'emulsione al 2,5% di acqua in olio.

Miscelare le due fasi fino ad ottenere un'emulsione omogenea e stabile. Trasferire 200 microlitri dell'emulsione preparata sull'interfaccia di sospensione lipidica della soluzione oleosa formata in precedenza. Se si utilizza un tubo da 1,5 millilitri, è sufficiente chiudere il tubo.

Se si utilizza la provetta da cinque millilitri modificata, posizionare un tappo di gomma sulla punta della pipetta e trasferire delicatamente l'intera provetta in una provetta conica da 50 millilitri. Centrifugare le provette a temperatura ambiente alla velocità appropriata. Dopo la centrifugazione, verificare che sia presente un pellet opaco sul fondo e che la fase oleosa sia limpida nella parte superiore.

Per rimuovere l'olio dalla provetta da cinque millilitri contenente GUV, recuperare il puntale della pipetta dal tubo assicurandosi che il tappo di gomma rimanga in posizione. Eliminare la punta e conservare il cappuccio di gomma, l'O-ring e il tappo di tenuta per un uso futuro. Invece, se si utilizza una provetta da 1,5 millilitri, utilizzare una micropipetta P1000 per rimuovere la soluzione oleosa, lasciando circa 50 microlitri e facendo attenzione a non disturbare il pellet.

Sostituire il puntale della pipetta, quindi risospendere il pellet nei restanti 50 microlitri di soluzione. Infine, trasferire il materiale risospeso in un tubo pulito da due millilitri. Le soluzioni lipidiche preparate in condizioni di elevata umidità hanno prodotto vescicole unilamellari giganti con rese significativamente inferiori e una maggiore prevalenza di aggregati disordinati rispetto a quelle preparate in una camera a umidità controllata, sebbene in quest'ultima fossero ancora presenti alcuni aggregati.

A 3.300 g per 20 minuti, la resa e la qualità delle vescicole caricate con saccarosio erano ottimali, mentre velocità di centrifugazione inferiori e superiori hanno portato a risultati sfavorevoli, come una resa ridotta o la formazione di aggregati. L'olio minerale ha prodotto vescicole con una distribuzione del diametro medio più ampia, mentre l'olio siliconico AR 20 ha generato un numero complessivo di vescicole significativamente più elevato.