Analisi 3D simultanea del danno cardiaco e della risposta immunitaria nell'infarto miocardico acuto riperfuso mediante microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Stiamo osservando l'interazione tra cellule immunitarie e tessuto danneggiato dopo l'infarto del miocardio. Il nostro obiettivo è comprendere la risposta immunitaria e migliorare la funzione cardiaca. È stato proposto che dopo l'infarto del miocardio, tutte e tre le principali entità cellulari, i cardiomiociti e le cellule e le cellule immunitarie debbano essere modulate contemporaneamente da strategie multi-target.

Oltre all'analisi simultanea del danno cardiaco e della risposta, abbiamo potuto mostrare la localizzazione 3D di queste aree danneggiate, che era precedentemente sconosciuta. L'analisi 3D, soprattutto quando si multiplexano vari bersagli, fornisce un modo più robusto per valutare la composizione cellulare dopo l'infarto del miocardio. Per iniziare, metti il topo soppresso sotto uno stereomicroscopio.

Usando le forbici sottili, aprire la cavità toracica e incidere la vena cava superiore esposta vicino all'uscita del vaso dalla gabbia toracica al collo. Utilizzando un ago calibro 27 collegato a una pompa a rulli, perfondere il cuore in situ attraverso gli oracoli atriali destro e sinistro con PBS contenente eparina. Confermare una sufficiente rimozione del sangue cardiaco osservando lo sbiadimento del disegno vascolare superficiale del cuore e lo sbiancamento del polmone e del fegato.

Asportare il cuore insieme ad almeno cinque millimetri dell'aorta rimanente e del tessuto polmonare circostante usando pinze e forbici e trasferirlo in una capsula di Petri di sei centimetri preriempita con PBS ghiacciato e garza. Ora, taglia via il polmone rimanente, il grasso e il tessuto vascolare fino a quando rimane solo il cuore con circa cinque millimetri di aorta. Trasferire il cuore in un piatto preparato per l'incannulamento aortico e tirare l'aorta rimanente su una cannula di acciaio smussato calibro 20.

Fissalo alla tacca della cannula con una sutura 5-0. Legare l'arteria discendente anteriore sinistra in modo permanente con una sutura 6-0 nella posizione utilizzata per l'induzione dell'infarto miocardico acuto riperfuso. Iniettare 400 microlitri di PBS contenenti 20 microgrammi di anticorpo NT CD31 di topo, marcato con un LexaFluor 546 per via retrograda tramite la cannula inserita.

Estrarre con cautela la cannula dall'aorta e trasferire il cuore in una provetta di reazione in polipropilene da 15 millilitri contenente 10 millilitri di paraformaldeide al 4%. Incubare la provetta per una notte a quattro gradi Celsius al buio senza agitazione. Lavare il cuore fissato in tre cambi da cinque millilitri di PBS per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente al buio, utilizzando la rotazione quasi sopra la testa per l'agitazione all'interno di provette di reazione in polipropilene da cinque millilitri.

Disidratare il cuore fissato in cinque millilitri di etanolo al 50% in acqua deionizzata per almeno due ore a temperatura ambiente al buio, agitando con rotazione quasi sopra la testa in provette di reazione da cinque millilitri. Per sbiancare il cuore disidratato, trasferirlo in una provetta di reazione da 15 millilitri contenente 10 millilitri di etanolo al 100% con il 5% di dimetilsolfossido e il 5% di perossido di idrogeno e incubarlo a quattro gradi Celsius al buio per quattro ore senza agitazione. Lavare il cuore sbiancato in cinque millilitri di etanolo al 100% tre volte per 12 ore ciascuna a temperatura ambiente al buio, utilizzando la rotazione quasi sopra la testa per l'agitazione in provette di reazione da cinque millilitri.

Trasferire il cuore in una provetta di reazione da cinque millilitri contenente quattro millilitri di cinnamato di etile e incubarlo senza agitazione per tre giorni a temperatura ambiente al buio. Tagliare i blocchi di gel e gomma chiari a una dimensione che stabilizzi il cuore chiarito nel portacampioni del microscopio. Per l'acquisizione dell'immagine utilizzare un obiettivo con apertura numerica di 0,1 con una distanza di lavoro di 17,6 millimetri.

Quindi rilevare i segnali di fluorescenza utilizzando le impostazioni appropriate del filtro di eccitazione ed emissione. Per l'imaging al microscopio a foglio ottico, scegliere un'apertura numerica del foglio di 0,079, con uno spessore del foglio leggero di cinque micrometri. Impostare la distanza tra due singoli piani Z su 10 micrometri.

Utilizzare una larghezza del foglio del 100% per ottenere un'illuminazione omogenea del campione. In questa figura sono illustrate le fette di cuore rappresentative che localizzano l'area a rischio, il danno endoteliale e i neutrofili infiltrati utilizzando la colorazione multicanale degli anticorpi e l'autofluorescenza. L'area a rischio è stata identificata dall'assenza di colorazione CD31 dopo iniezione retrograda, dal danno endoteliale da negatività CD31 per via endovenosa e dai neutrofili infiltranti da punti Ly6G-positivi, per lo più vicino alle zone di lesione.

I rendering 3D hanno mostrato una sovrapposizione tra AAR, lesione endoteliale e cluster di neutrofili, suggerendo una localizzazione immunitaria region-specifica. La quantificazione ha mostrato il 90,2% dei neutrofili in AAR rispetto al 9,8% nelle regioni remote, indicando un'infiammazione localizzata. All'interno dell'AAR, il 79,3% dei neutrofili era al di fuori dei volumi di danno endoteliale e il 20,7% all'interno, suggerendo un raggruppamento periferico intorno al danno.