Name: Preparazione automatizzata di 68Ga Ga-3BP-3940 su un modulo di sintesi per limaging PET del microambiente tumorale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Scopri il protocollo automatizzato per la sintesi di Gallio 68 3BP3940, un radiofarmaco per imaging PET del microambiente tumorale. Questo metodo garantisce conformità GMP e produzione in soli 20 minuti.

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Negli ultimi anni, il targeting del microambiente tumorale (TME) ha suscitato un notevole interesse nelle applicazioni diagnostiche e terapeutiche1. L'abbondanza di tipi di cellule, molecole di segnalazione e macromolecole di matrice extracellulare (ECM) all'interno della TME offre un'ampia gamma di potenziali bersagli molecolari2. Tra le cellule ospiti residenti e infiltranti, i fibroblasti associati al cancro (CAF) formano un sottogruppo distinto di fibroblasti all'interno della TME, fenotipicamente diversi dai fibroblasti normali. I CAF svolgono un ruolo cruciale nella progressione tumorale, nelle metastasi, nell'evasione immunitaria e nella resistenza alla terapia grazie a caratteristiche cellulari e molecolari uniche3. Queste cellule mesenchimali mostrano un fenotipo attivato caratterizzato dall'espressione della proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP). Molecolarmente, i CAF secernono una complessa serie di citochine, chemochine, fattori di crescita (ad esempio, TGF-β, IL-6 e CXCL12) e proteine della MEC (ad esempio, collagene, fibronectina), che rimodellano la MEC e favoriscono un ambiente pro-tumorigenico4.
Essendo una proteina altamente specifica che è sovraespressa e localizzata sulla superficie extracellulare della membrana CAF, la FAP mostra tutte le caratteristiche di un bersaglio molecolare affidabile, specialmente per la medicina nucleare e le applicazioni radiofarmaceutiche5. In questo contesto, sono stati sviluppati inibitori di piccole molecole di FAP a base di chinolina (FAPI), funzionalizzati con un gruppo DOTA, e rapidamente introdotti nell'uso clinico 6,7,8. In particolare, FAPI-04 e FAPI-46 radiomarcati con gallio-68 (emettitore β+, t1/2 = 68 min) per l'imaging con tomografia a emissione di positroni (PET) hanno dimostrato un valore significativo nelle malattie fibrotiche, in cardiologia e in oncologia 8,9, in particolare per i tumori in cui il [18F]fluorodesossiglucosio ([18F]FDG) ha un'utilità limitata10. Tuttavia, mentre i loro contributi all'oncologia e all'imaging delle malattie non maligne sono innegabili, i FAPI a piccole molecole mostrano alcune limitazioni per le applicazioni di terapia con radionuclidi mirati (TRT), in particolare a causa del loro tempo di permanenza intratumorale non ottimale, che può portare a un'irradiazione involontaria del tessuto sano11. Per affrontare questo problema, sono state esplorate diverse strategie, come la progettazione di ligandi multivalenti11,12 o l'uso di radionuclidi terapeutici con emivite brevi 13,14,15. Sono stati inoltre sviluppati nuovi scaffold molecolari con un'elevata affinità per la FAP e che innescano un'alta percentuale di internalizzazione cellulare.
Uno di questi è il derivato pseudopeptidico FAP-2286. Contiene una sequenza di 7 aminoacidi, ciclizzata e legata a un chelante DOTA da una porzione 1,3,5-benzenetrimetanetiolo16. Uno studio iniziale sull'uomo ha dimostrato che [68Ga]Ga-FAP-2286 mostra un profilo di biodistribuzione simile a [68Ga]Ga-FAPI-46, con un assorbimento fisiologico leggermente superiore nel fegato, nei reni e nel cuore17. In questo studio, 64 pazienti, principalmente con tumori del collo, del fegato, dello stomaco, del pancreas, delle ovaie e dell'esofago, sono stati sottoposti a imaging PET con [68Ga]Ga-FAP-2286 per la stadiazione del cancro o il rilevamento della recidiva: l'assorbimento di [68Ga]Ga-FAP-2286 è stato notevolmente superiore a [18F]FDG nei tumori primari, nelle metastasi linfonodali e nelle metastasi a distanza, migliorando il contrasto dell'immagine e la rilevabilità della lesione. Tutti i tumori primari erano visibili con [68Ga]Ga-FAP-2286 PET/CT, mentre [18F]FDG PET/CT ha mancato quasi il 20% delle lesioni. Per i linfonodi coinvolti, i tassi di rilevamento erano più alti con [68Ga]Ga-FAP-2286, così come per le metastasi ossee e viscerali. Un altro studio in un gruppo più piccolo di 21 pazienti con una varietà di malattie tumorali ha anche dimostrato l'eccellente sensibilità di questo agente di imaging, riflettendo l'efficienza diagnostica di [68Ga]Ga-FAP-228618. Studi più specifici si sono concentrati su un singolo tipo di cancro, come il cancro uroteliale o polmonare, evidenziando ancora una volta l'alto potenziale di [68Ga]Ga-FAP-2286 per l'imaging molecolare clinico 4,5. Per quanto riguarda la terapia, uno studio preliminare ha esaminato l'uso di FAP-2286 radiomarcato con lutezio-177 (emettitore di β-, t1/2 = 6,7 d) in 11 pazienti con diversi tumori metastatici progressivi19. La maggior parte dei pazienti ha ricevuto due cicli di trattamento distanziati di 8 settimane l'uno dall'altro e la dose media somministrata per ciclo è stata di 5,8 ± 2,0 GBq di [177Lu]Lu-FAP-2286. Il farmaco ha dimostrato una prolungata ritenzione intratumorale, con un'emivita efficace di circa 44 ore nelle metastasi ossee. Dati gli effetti collaterali accettabili, questi risultati hanno aperto la strada a studi clinici su larga scala: la sicurezza e l'efficacia di [177Lu]Lu-FAP-2286 sono attualmente in fase di valutazione nello studio clinico di fase 1/2 LuMIERE, sponsorizzato da Novartis (NCT04939610)7,8. Ulteriori protocolli di ricerca su scala ridotta sono documentati in letteratura 9,20 e sono stati pubblicati diversi casi clinici 21,22,23,24,25,26, dimostrando l'efficacia e l'eccellente tollerabilità di questa TRT.
Le modifiche minime apportate alla struttura del FAP-2286 hanno portato all'analogico ottimizzato 3BP-3940 (Figura 1)27. Sebbene la letteratura scientifica su questa molecola vettore rimanga limitata, sono stati condotti i primi studi sia per l'imaging che per le applicazioni terapeutiche. Un rapporto preliminare descrive l'uso di [68Ga]Ga-3BP-3940 in 18 pazienti con vari carcinomi metastatici allo stadio terminale e conclude che questo radiofarmaco è un agente di imaging PET adatto, sottolineando il suo eccellente rapporto tumore-fondo e la captazione renale molto bassa28. In un altro lavoro, un singolo paziente con carcinoma pancreatico con metastasi epatiche ha ricevuto 150 MBq di [68Ga]Ga-3BP-3940 per l'imaging PET, che ha dimostrato un'intensa captazione nel tumore primario e nelle lesioni metastatiche29. Lo stesso paziente ha successivamente ricevuto una singola dose di 9,7 GBq di [177Lu]Lu-3BP-3940 per TRT. Il trattamento è stato ben tollerato, senza cambiamenti significativi nei segni vitali o nei parametri biologici. Un altro studio ha presentato i risultati iniziali sull'uomo di un approccio teranostico utilizzando 3BP-3940: i pazienti sono stati selezionati con l'imaging PET [68Ga]Ga-3BP-3940 e poi hanno ricevuto 3BP-3940 marcato con diversi isotopi (177Lu, 90Y o 225Ac), somministrato da solo o in combinazioni tandem (ad esempio, 177Lu + 225Ac) in 1-5 cicli di trattamento30. Gli esiti includevano una remissione completa, quattro remissioni parziali, tre malattie stabili e 12 progressioni della malattia. La sopravvivenza globale mediana della coorte (n = 28) è stata di 9 mesi dall'inizio della TRT.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68356/68356fig01.jpg"> 
Figura 1: Struttura chimica di [68Ga]Ga-3BP-3940. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68356/68356fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il processo di radiomarcatura a 68Ga per radiofarmaci sperimentali come FAP-2286 e 3BP-3940 prevede generalmente un modulo di sintesi per automatizzare la fase di preparazione. In particolare, l'automazione dei metodi garantisce la robustezza del processo e la conformità alle GMP e riduce al minimo l'esposizione dell'operatore alle radiazioni rispetto ai metodi di preparazione manuale 31,32,33. In molti casi, tale protocollo è atteso dalle autorità regolatorie come parte di un dossier di medicinale sperimentale (IMPD) prima di autorizzare un centro a produrre il corrispondente radiofarmaco sperimentale34. Ad oggi, in letteratura sono disponibili pochissime informazioni dettagliate sulla radiomarcatura automatizzata del 68Ga degli pseudopeptidi anti-FAP 29,35,36,37,38. Inoltre, i dati riportati si applicano generalmente solo a un dato modello di sintetizzatore. Il tipo di generatore da 68Ga utilizzato può anche portare alcune specificità, poiché le diverse soluzioni disponibili in commercio sono caratterizzate da volumi specifici di eluato 68Ga3+ in HCl (solitamente 0,1 M), che possono avere un impatto diretto sulle condizioni di radiomarcatura automatizzata.
In questo contesto, presentiamo un protocollo dettagliato per la radiomarcatura automatizzata rapida ed efficiente dello pseudopeptide 3BP-3940 con 68Ga, utilizzando il modulo di sintesi GAIA V2. Questo sintetizzatore si basa sull'uso di un set di tubi composto da tre rampe di cinque collettori ciascuna, collegate a una pompa peristaltica per controllare il flusso del fluido. Dispone inoltre di un forno a fiala per il riscaldamento del mezzo di reazione, diverse sonde di radioattività e un sensore di pressione per monitorare questi parametri all'interno del sistema. Anche se non così diffuso come alcuni altri modelli, questo automa viene utilizzato abitualmente nel nostro centro ed è installato in un numero crescente di strutture 31,39,40,41,42,43,44. In questo lavoro è stato utilizzato un generatore GALLIAD 68Ge/68Ga senza prepurificazione dell'eluato da 68Ga. Questo metodo è progettato per offrire una soluzione robusta, veloce e conveniente per la produzione di [68Ga]Ga-3BP-3940, ottimizzando anche la protezione dalle radiazioni per gli operatori durante la radiomarcatura. Questo è anche il primo protocollo di preparazione per questo radiofarmaco ad essere riportato su questo specifico modello di sintetizzatore, e in modo così dettagliato.

<table><tbody><tr><td>Filtri 0,2 & micro;</td><td>VWR</td><td>514-0515</td><td>Per la filtrazione di soluzioni tampone e antiossidanti e prodotto finale di radiomarcatura</td></tr><tr><td>Acetonitrile per HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851-2.5L</td><td>Per il controllo HPLC della purezza radiochimica Acetato di</td></tr><tr><td>ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238074</td><td>Per la preparazione di una delle fasi mobili per il controllo TLC</td></tr><tr><td>Colonna C18 per HPLC</td><td>VWR</td><td>EQV-3C18-1503</td><td>Per il controllo HPLC della purezza radiochimica</td></tr><tr><td>Calibratore di dose calibrato (CRC25)</td><td>Capintec-Per</td><td></td> <td>la misurazione della radioattività del prodotto finale e dei vari componenti del modulo post-sintesi</td></tr><tr><td>Soluzione tampone citrato, pH 4</td><td>Thermofisher</td><td>258585000</td><td>Fase mobile per controlli TLC</td></tr><tr><td>Provetta Eppendorf 5 mL Biopur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP0030119479</td><td>Per la preparazione di soluzioni tampone e antiossidanti</td></tr><tr><td>Linea di prolunga (30 cm)</td><td>Vygon</td><td>1159.03</td><td>Per il collegamento del generatore al set di tubi</td></tr><tr><td>Generatore di gallio-68</td><td>IRE Elit-Per</td><td></td> <td>la generazione in situ di [68Ga]cloruro di gallio</td></tr><tr><td>Contatore gamma (Hidex AMG)</td><td>Hidex-Per</td><td></td> <td>la valutazione dell'emivita e della purezza radiochimica</td></tr><tr><td>Stazione HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>-</td><td>Per il controllo HPLC della purezza radiochimica</td></tr><tr><td>Piastre iTLC-SG</td><td>Agilent SGI0001</td><td></td><td>Per il controllo TLC della purezza radiochimica</td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>AppliChem</td><td>A1340</td><td>Per la preparazione di soluzioni antiossidanti</td></tr><tr><td>Adattatore maschio/maschio</td><td>Vygon</td><td>893.00</td><td>Per il collegamento del generatore al set di tubi</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320390-1L</td><td>Per la preparazione di una delle fasi mobili per il controllo TLC</td></tr><tr><td>Aghi (21G, Sterican)</td><td>B Braun</td><td>4657543B</td><td>Per trasferimenti di soluzione prima della radiomarcatura</td></tr><tr><td>pH carta</td><td>VWR</td><td>85409.600</td><td>Per testare il pH del prodotto per la radiomarcatura</td></tr><tr><td>Pipetta 1000 &; L (Gilson PIPETMAN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12346132-1000</td><td>Per la misurazione e il trasferimento precisi</td></tr><tr><td>di liquidi Pipetta 200 &; L (Gilson PIPETMAN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12326132-200</td><td>Per la misurazione e il trasferimento precisi</td></tr><tr><td>di liquidi Puntali per pipette, 100-1000 &mu; L</td><td>Charles River</td><td>D1000IW</td><td>Per la misurazione e il trasferimento precisi di liquidi</td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 2-200 &; L</td><td>Charles River</td><td>D200IW</td><td>Per la misurazione e il trasferimento precisi dei liquidi</td></tr><tr><td>Radiocromatografo</td><td>Elysia-Raytest-Per</td><td></td> <td>il controllo TLC della purezza radiochimica</td></tr><tr><td>Radiosensore per HPLC</td><td>Elysia-Raytest-Per</td><td></td> <td>il controllo HPLC della purezza radiochimica</td></tr><tr><td>Kit reagenti</td><td>ABX</td><td>RT-101</td><td>Fornisce etanolo 60%, NaCl 0,9%, sacchetto WFI, cartuccia C18, 0,2 e micro; filtro terminale, aghi di aerazione, ago terminale e fiala di scarto</td></tr><tr><td>Contenitore schermato</td><td>LemerPax</td><td></td><td>Per l'attenuazione delle radiazioni del prodotto di radiomarcatura</td></tr><tr><td>Spatola in plastica monouso</td><td>Corning</td><td>3005</td><td>Per la preparazione di reagenti</td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato EMPROVE</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.28204</td><td>Per la preparazione di tamponi di reazione</td></tr><tr><td>Fiale sterili sigillate (tipo di vetro 1)</td><td>Curium</td><td>TC-ELU-5</td><td>Per il condizionamento finale di soluzioni tampone, antiossidanti e di radiomarcatura</td></tr><tr><td>Set di tubi sterili</td><td>ABX</td><td>RT-01-H</td><td>Per la sintesi automatizzata di [68Ga]Ga-3BP-3940</td></tr><tr><td>Acqua sterile per irrigazione</td><td>B Braun</td><td>0082479E</td><td>Per la preparazione di una delle fasi mobili per il controllo TLC</td></tr><tr><td>Modulo di sintesi (GAIA)</td><td>Elysia-Raytest</td><td>-</td><td>Per la sintesi automatizzata di [68Ga]Ga-3BP-3940</td></tr><tr><td>Siringa (1 mL, basso volume morto)</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Per il condizionamento del peptide nel tampone e l'aggiunta di metionina in NaCl 0,9%</td></tr><tr><td>Siringhe (10 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309649</td><td>Per la metionina in NaCl 0,9% e il condizionamento</td></tr><tr><td>Siringhe (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td>Per il condizionamento al 60% di metionina</td></tr> <tr><td>ed etanoloSerbatoi di migrazione TLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-212-281</td><td>Per il controllo TLC della purezza radiochimica Acido</td></tr><tr><td>trifluoroacetico (adatto per HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031-100ML</td><td>Per il controllo HPLC della purezza radiochimica</td></tr><tr><td>Provette per contatore gamma</td> <td>-</td><td></td> <td>Per la preparazione di saggi di emivita e purezza radiochimica</td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni</td><td>Selecta</td><td>3000683</td><td>Per la sonicazione di soluzioni preparate</td></tr><tr><td>Molecola vettoriale (3BP-3940)</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P10131&nbsp;</td><td>Molecola vettore da radiomarcare</td></tr><tr><td>Flacone per HPLC con inserto in vetro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>29385-U e SU860066</td><td>Per il controllo HPLC della purezza radiochimica</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>VWR</td><td>444-5900P</td><td>Per l'agitazione delle soluzioni preparate</td></tr><tr><td>Acqua per HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34877-2.5L-M</td><td>Per il controllo HPLC della purezza radiochimica</td></tr><tr><td>Acqua per preparazioni iniettabili, fiasche da 10 mL</td><td>Aguettan</td><td>34009 370 641 0 1</td><td>Per soluzioni preparazione</td></tr></tbody></table>

preparazione automatizzata di [68ga]ga-3bp-3940 su un modulo di sintesi per l'imaging pet del microambiente tumorale

Automated Preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940 on a Synthesis Module for PET Imaging of the Tumor Microenvironment

Il processo di sintesi sviluppato sul modulo GAIA consente la radiomarcatura rapida a 68Ga di 3BP-3940 in 21-22 min. Questo protocollo è stato progettato per funzionare con il generatore di grado farmaceutico 68Ge/68Ga GALLIAD, che produce 1,1 mL di eluato di 68Ga in 0,1 M HCl. Il volume e la molarità del tampone di reazione sono stati finemente regolati in base a questa quantità di acido per ottenere un pH di reazione compreso tra 3,5 e 4, necessario per una radiomarcatura ott...

Preparazione automatizzata di [68Ga]Ga-3BP-3940 su un modulo di sintesi per l'imaging PET del microambiente tumorale

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe ...

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