Isolamento, coltura e caratterizzazione dei fibroblasti associati al cancro alla prostata

Il nostro obiettivo è comprendere il meccanismo attraverso il quale i fibroblasti associati al cancro contribuiscono alla progressione tumorale nel cancro alla prostata con l'obiettivo di neutralizzare questo crosstalk come strategia terapeutica. Popolazioni distinte di CAF con proprietà diverse possono essere valutate in organoidi 3D ottenuti utilizzando cellule tumorali e stromali dopo varie manipolazioni. Il nostro protocollo consente di generare in modo affidabile CAF per questi scopi.

Le sfide principali sono l'isolamento affidabile di cellule tumorali e normali dagli stessi microambienti dei pazienti, l'eterogeneità, l'assenza di marcatori CAF specifici, la plasticità dei CAF e i limitati modelli in vitro che ricapitolano la complessità della TME. Con metodi simili, abbiamo caratterizzato il ruolo pro-tumorale fondamentale del fattore di trascrizione STAT3 e dei suoi geni bersaglio nei CAF murini per carcinoma mammario, dimostrando la loro efficacia come bersagli terapeutici. Un isolamento ottimale dei fibroblasti dal tumore e dalle regioni normali adiacenti di campioni di prostatectomia radicale ottenuti da pazienti con cancro alla prostata utilizzando una piccola quantità di tessuto.

Per iniziare, pesare i campioni di tessuto sulla bilancia il primo giorno per l'isolamento dei fibroblasti. Usando una pinza sterile, trasferisci il tessuto in piatti di sei centimetri. Lavare il fazzoletto due volte in quattro millilitri di PBS ghiacciato e due volte in quattro millilitri di DMEM completo ghiacciato.

Ora, trasferisci il fazzoletto in un piatto di sei centimetri con ghiaccio. Aggiungere un millilitro di DMEM integrato con antibiotici alla piastra. Quindi usa le forbici o le lame per tritare il tessuto in frammenti più piccoli di un millimetro quadrato.

Trasferire il tessuto macinato in una provetta conica da 15 millilitri contenente cinque millilitri di DMEM completo ghiacciato. Quindi centrifugare la sospensione a 754 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, rimuovere il surnatante.

Risospendere il pellet in cinque millilitri di DMEM ghiacciato, completare e centrifugare nuovamente. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet in soluzione di collagenasi II. Trasferire la sospensione in microprovette da 1,5 millilitri.

Sigillare le microprovette con un film di paraffina. Quindi posizionarli a 37 gradi Celsius per la digestione notturna con dondolo continuo per otto-12 ore. Il giorno successivo, trasferire i campioni digeriti in provette coniche da 15 millilitri.

Pipettare cinque millilitri di DMEM completo ghiacciato per inattivare la collagenasi. Quindi centrifugare la sospensione a 754 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet in un millilitro di tripsina-EDTA allo 0,05% dopo aver pipettato il surnatante.

Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius agitando di tanto in tanto. Quindi, pipettare un millilitro di soluzione di DNasi I appena preparata nei campioni e mescolare bene. Dopo aver centrifugato e rimosso il surnatante, risospendere il pellet in cinque millilitri di DMEM a freddo, completare e centrifugare nuovamente.

Risospendere le cellule risultanti in DMEM completo integrato con siero fetale bovino al 20%. Placcare le cellule e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 95% di umidità per almeno tre giorni. Dopo tre giorni, esaminare le cellule per verificarne la morfologia e la vitalità.

Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, passatele in un piatto di 10 centimetri contenente DMEM completo con il 20% di siero fetale bovino. Fibroblasti associati al cancro su piastra o fibroblasti normali al 70% di confluenza in piastre a 12 pozzetti. Il giorno seguente, aggiungere 0,45 grammi di agar a basso punto di fusione a 12,5 millilitri di PBS in una provetta conica da 50 millilitri in condizioni sterili.

Sciogliere il composto utilizzando un forno a microonde. Raffreddare la soluzione di agar fino a 37 gradi Celsius. Quindi diluire in un rapporto da uno a quattro con DMEM completo preriscaldato per preparare una soluzione funzionante.

Aspirare il terreno dalla piastra a 12 pozzetti. Pipettare 500 microlitri della soluzione di agar di lavoro in ogni pozzetto. Incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius per consentire la solidificazione dell'agar.

Nel frattempo, mantieni la soluzione di agar rimanente a 37 gradi Celsius. Tripsinizzare le cellule tumorali e preparare una sospensione cellulare di 20.000 cellule per millilitro. Mescolare volumi uguali della sospensione di cellule tumorali e della soluzione di agar per ottenere un volume finale di sette millilitri, pari a tre repliche tecniche per ciascuna condizione.

Pipettare su e giù più volte per garantire una miscelazione uniforme. Quindi erogare 500 microlitri di questa miscela contenente circa 5.000 cellule sopra lo strato di base solidificato in ciascun pozzetto. Dopo aver lasciato solidificare l'agar per 20 minuti a quattro gradi Celsius, aggiungere un millilitro di DMEM completo a ciascun pozzetto.

Cambia il terreno a giorni alterni aspirando delicatamente dal bordo del pozzetto e aggiungendo terreno fresco al centro. Incubare fino a quando le colonie diventano facilmente visibili. Una volta che le colonie sono visibili, scarta il terreno di coltura.

Quindi colorare le colonie con 200 microlitri di soluzione di cloruro di nitro blu tetrazolio. Incubare per una notte a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata. Il giorno successivo, scartare la soluzione colorante.

Acquisisci immagini di colonie colorate utilizzando uno stereomicroscopio. I fibroblasti puri sono stati isolati con successo. In molti casi, in particolare nei primi passaggi, i fibroblasti associati al cancro hanno mostrato una morfologia più simile a un fuso rispetto ai fibroblasti normali.

L'analisi quantitativa ha confermato che la proliferazione delle cellule DU145 trattate con terreni condizionati da fibroblasti associati al cancro era significativamente più elevata nell'arco di 120 ore rispetto a quelle trattate con terreni condizionati da fibroblasti normali o non trattate. Anche le cellule DU145 co-coltivate direttamente con fibroblasti associati al cancro e fibroblasti normali hanno mostrato un aumento della proliferazione nell'arco di 96 ore rispetto ai controlli. Le corrispondenti curve di crescita hanno dimostrato che la co-coltura con fibroblasti normali e associati al cancro ha portato a un aumento simile della proliferazione di DU145 nel tempo.

L'effetto dei terreni condizionati sulla proliferazione di DU145 variava tra le coppie di fibroblasti associati al cancro e quelle di fibroblasti normali, con coppie di passaggio precoci che mostravano effetti significativamente più forti rispetto a quelle successive. Nei saggi di formazione di colonie di agar morbido, sia i fibroblasti associati al cancro che quelli normali hanno aumentato il numero e le dimensioni delle colonie di DU145 rispetto ai controlli, indicando una maggiore crescita indipendente dall'ancoraggio. Gli strati di fibroblasti staccati formatisi a causa di problemi tecnici hanno impedito la formazione di colonie in alcune repliche.

I terreni condizionati da soli non hanno promosso la formazione di colonie indipendenti dall'ancoraggio nelle cellule DU145.