Desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice guidata da fluorescenza con spettrometria di massa di postionizzazione indotta da laser di singole cellule neurali di ratto

La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di flussi di lavoro di spettrometria di massa MALDI a singola cellula ad alto rendimento, guidati da immagini, per rivelare l'eterogeneità cellulare e per collegare i profili molecolari all'identità, alla funzione e alla risposta cellulare in sistemi complessi.

Strumentazione avanzata, come MALDI-2 e spettrometri di massa ad alta risoluzione spaziale, consente un'analisi mirata e spazialmente risolta di singole cellule, migliorando la sensibilità e ampliando l'ambito della profilazione molecolare in tessuti complessi. Le sfide attuali includono la sensibilità limitata, la riproducibilità tra i campioni e l'analisi complessa dei dati. I dati MALDI sono spesso scarsi e grandi set di dati con migliaia di cellule e centinaia di molecole richiedono strumenti computazionali robusti.

Questo protocollo colma il divario nei metodi ad alto rendimento per l'analisi delle singole cellule e persino degli organelli, consentendo studi molto dettagliati sull'eterogeneità e acquisendo informazioni sulla biologia e la funzione molecolare e cellulare.

Questo protocollo consente un'analisi rapida e mirata delle cellule sparse sul vetrino, eliminando la necessità di manipolazione cellulare o di scansione dell'intera area e aumentando significativamente la produttività.

[Narratore] Per iniziare, sciacquare ogni vetrino con due o tre millilitri di acetato di ammonio da 150 millimolari per rimuovere i cristalli di glicerolo e sale che possono interferire con la microscopia e l'applicazione della matrice MALDI, quindi asciugare i vetrini sotto un leggero flusso di azoto o lasciarli asciugare completamente all'aria. Caricare il vetrino essiccato nel tavolino del microscopio. Mettere a fuoco il microscopio utilizzando almeno 10 punti di appoggio distribuiti uniformemente su tutto il vetrino. Utilizzando filtri adatti per DAPI e imaging in campo chiaro, acquisire un'immagine a fluorescenza affiancata dell'intero vetrino con un ingrandimento da 5x a 10x, assicurando che i marcatori fiduciali sui vetrini per microscopia siano chiaramente catturati nell'immagine. Unisci le immagini piastrellate utilizzando un software di microscopia, come ZEN ZEISS. Verificare che le tessere adiacenti verticalmente non siano sfalsate. Elabora ed esporta ogni immagine unita come file BigTIFF utilizzando il software di microscopia o come TIFF standard se la dimensione finale dell'immagine è inferiore a due gigabyte. Sciogliere 20 milligrammi di 2,5-diidrossiacetofenone in 1,5 millilitri di acetone. Posizionare i vetrini nel supporto della camera di sublimazione, quindi posizionare il supporto nell'apparecchio di sublimazione. Pipettare la soluzione di matrice disciolta sul wafer di ceramica e lasciare evaporare completamente l'acetone, quindi chiudere la camera di sublimazione per sigillarla. Riempire la camera del refrigerante con una granita di acqua ghiacciata e posizionarla saldamente sopra la camera di sublimazione. Accendere la pompa del vuoto e lasciare che il sistema si equilibri per cinque minuti. Iniziare la sublimazione riscaldando la camera a 200 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo cinque minuti, rimuovere il bagnomaria con acqua ghiacciata dalla camera. Alza la temperatura a 25 gradi Celsius e posiziona un dissipatore di calore sopra la camera. Sfiatare lentamente la camera di sublimazione per rilasciare la pressione. Aprire la camera e rimuovere con cautela i vetrini. Aprite MicroMS e decimate le immagini al microscopio BigTIFF utilizzando l'opzione del gruppo di immagini per ospitare sia i canali di campo chiaro che quelli di fluorescenza. Passare allo strumento Opzioni BLOB e regolare le dimensioni massime e minime del BLOB per definire l'intervallo di dimensioni del BLOB accettabile. Impostare la soglia del canale di fluorescenza per il rilevamento dei blob. Specificare il valore di circolarità per definire il livello di circolarità delle celle identificate e scegliere il colore. Usare l'opzione Trova BLOB per rilevare i BLOB. Quando richiesto, salvare l'elenco BLOB con il nome desiderato. Usate lo strumento filtro distanza per impostare la distanza minima tra ogni cella. Testare l'errore tramite i punti di prova per determinare con precisione l'errore di offset. Caricare le diapositive nello strumento utilizzando l'MTP Slide Adapter II. Dopo essere tornati al computer con MicroMS, accedere al computer dello spettrometro di massa tramite un'applicazione desktop remoto. Se si utilizza lo strumento per la prima volta, verificarne la posizione accedendo a Strumenti, quindi a Impostazioni strumento. Nella finestra pop-up, visualizzare l'insieme di coordinate con le relative posizioni X e Y e selezionare ciascuno di questi punti specifici sulla geometria dell'adattatore scorrevole II. Aggiornare le posizioni X e Y nella finestra MicroMS. Utilizzando la fotocamera e i controlli del tavolino dello spettrometro di massa, naviga in una posizione facilmente identificabile sulla diapositiva e copia le coordinate dello strumento. In MicroMS, individuare la stessa posizione nell'immagine del microscopio, fare clic con il pulsante destro del mouse e inserire le coordinate nella finestra pop-up. Arrotonda le coordinate ai numeri interi più vicini e separali con uno spazio. Dopo che sono stati aggiunti tre punti di registrazione, uno dei cerchi diventerà rosso, indicando che è la posizione più lontana dalla registrazione. Elimina il punto di registrazione usando Ctrl + clic destro e riprova. In File, vai su Salva e poi su Registrazione per salvare il file di registrazione. Con i blob visibili sul vetrino, andare su File, Salva, quindi su Posizioni strumento per salvare il file di posizione dello strumento, quindi utilizzando il software desktop remoto, trasferire questo file sul computer dello strumento. Apri il file XEO personalizzato e copiane il contenuto nell'MTP Slide Adapter II . XEO sul computer dello strumento. Salvare il file per aggiornare il file di geometria con le posizioni delle celle. Fare clic sulla scheda Automazione e selezionare Nuovo per creare una nuova esecuzione automatica. Trascinare sulla regione del campione visualizzata per selezionare le celle e fare clic con il pulsante destro del mouse per aggiungerle all'elenco di analisi. Salvare l'esecuzione automatica e fare clic su Avvia esecuzione automatica per avviare l'acquisizione. Questa figura illustra come la profilazione della spettrometria di massa MALDI-2 a cellula singola riveli l'eterogeneità cellulare basata sui lipidi attraverso e all'interno di regioni cerebrali distinte. L'approssimazione e la proiezione uniforme delle varietà, o analisi UMAP, hanno separato le cellule per regione cerebrale, formando cluster distinti per striato, ippocampo e corteccia. Il clustering di Leiden ha rivelato quattro sottopopolazioni cellulari basate sui lipidi. Inoltre, sono state osservate firme lipidiche specifiche per cluster, con profili di intensità distinti tra i lipidi annotati. Anche gli spettri di massa di sei cellule corticali hanno mostrato un rilevamento coerente dei lipidi tra i vetrini. Inoltre, le cellule corticali di diversi vetrini hanno mostrato distribuzioni UMAP sovrapposte, indicando effetti batch minimi.