Campionamento ambientale di microbi fotosintetici e dei loro virus: dal campo al laboratorio

L'obiettivo di questi progetti è quantificare i parametri fisiologici nelle infezioni virali, quindi mappare i substrati ohmici sulla fisiologia osservata, portando a modelli o leggi in virologia che prevedono cambiamenti nelle dinamiche virus-ospite. Grazie ai progressi nel sequenziamento ad alto rendimento e ai flussi di lavoro bioinformatici semplificati, le analisi multi-ohmiche sono facilmente accessibili, il che offre l'opportunità di spiegare i fenomeni fisiologici in funzione di specifici substrati ohmici. Utilizzando infezioni sperimentali, microscopia elettronica, sequenziamento quantitativo di nuova generazione PCR e robuste pipeline bioinformatiche, le analisi di rete possono identificare le relazioni tra ohmica e variabili fisiologiche che informano lo sviluppo di modelli predittivi.

La sfida più grande consiste nel generare stock virali puri a genotipo singolo con titoli accurati, in modo da poter determinare la molteplicità dell'infezione per le infezioni sperimentali. La determinazione del titolo rimane un problema in virologia. Abbiamo sviluppato metriche per calcolare la virulenza relativa tra due virus che infettano un ospite o un virus che infetta ospiti diversi in infezioni da un singolo ospite/virus singolo.

Abbiamo standardizzato un flusso di lavoro che funziona su tutti i sistemi antivirus. Per iniziare, esegui il campionamento ambientale offshore lungo la costa della California meridionale. Collegare un tubo flessibile in gomma resistente al collasso lungo 10 piedi all'uscita della pompa.

Collegare il cavo elettrico della pompa di trasferimento al generatore dell'inverter. Una volta assemblata, adescare la pompa di trasferimento e verificare che il sistema di pompaggio sia operativo. Fissare un'estremità di una corda marina in nylon lunga 25 metri, con un diametro di 1,25 centimetri, all'occhiello di un'ancora a fungo da 14 chilogrammi.

Usa del nastro adesivo per fissare la corda al tubo in PVC blu ogni tre metri. Una volta trasferito un flusso d'acqua costante, scaricare uno o due volumi di tubi nell'oceano per garantire che l'acqua dalla profondità desiderata scorra attraverso la pompa. Raccogli i campioni d'acqua in brocche d'acqua da 20 litri per trasportarli alla stazione sul campo.

Filtrare il campione d'acqua attraverso un gruppo coppa del filtro, quindi collegare la coppa del filtro a una pompa per vuoto a membrana dell'aria portatile utilizzando un tubo in vinile trasparente. Trasferire il campione nella tazza del filtro e iniziare la filtrazione. Al termine, trasferire il filtrato in un flacone di raccolta dell'acqua ed etichettarlo.

Ora usa un bisturi per ritagliare il filtro dal gruppo della tazza del filtro. Tagliatelo a metà e trasferitelo in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Trasferire 50 millilitri di acqua di mare filtrata nella stessa provetta da centrifuga.

Per concentrare i campioni misti, per ogni profondità di campionamento per sito, rispedire l'ultrafiltrato con un filtro da 0,45 micrometri carico di detriti cellulari al laboratorio e alla centrifuga. Trasferire 60 millilitri di filtrato in un filtro rotante. Centrifugare a 6.000 g per 10-20 minuti per concentrarlo.

Ripetere la centrifugazione fino ad ottenere un concentrato da 1,5 a 2 millilitri della sospensione del virus o del batteriofago. Trasferire il concentrato risultante in una provetta Eppendorf da due millilitri per l'ulteriore imaging al microscopio elettronico a trasmissione di virus o batteriofagi dal campione ambientale elaborato. Strisciare i campioni ambientali su piastre di agar preparate.

Per isolare isolati di singole colonie di presunti ospiti di virus o batteriofagi, utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per trasferire un isolato su una nuova piastra. Quindi usa lo stesso anello per raccogliere un'altra colonia e trasferirla in un pallone conico contenente brodo liquido. Preparare 10 colture di semi in provette da 20 millilitri contenenti cinque millilitri di terreno BG 11.

Aggiungere cinque millilitri di una miscela di ultrafiltrato dal sito di campionamento e BG-11. Prelevare una singola colonia isolata da una piastra di coltura con uno stuzzicadenti sterile, quindi inoculare ogni provetta singolarmente facendo cadere uno stuzzicadenti in ciascuna provetta. Una volta rilevata una crescita positiva della coltura del seme, ripetere le procedure di serie fino a quando non appare un solo fenotipo di colonia sulle piastre.

Una volta che i cicli di coltura liquida e di lavoro su piastra in terreni solidi producono un fenotipo a singola cellula, caratterizzare i morfotipi microbici utilizzando la microscopia ottica. Per rilevare l'attività del virus, coltiva prati ospiti putativi di cianobatteri o microalghe da ceppi di lavoro su piastre di agar BG-11. Una volta che le singole placche compaiono sulle piastre a causa di macchie o vortici sulla sospensione virale, utilizzare un anello sterile per raschiare una singola placca.

Agitare il ciclo in una coltura di semi da 10 millilitri dell'ospite. Per determinare l'intervallo di ospiti, preparare prati di più ospiti putativi isolati da campioni ambientali o ottenuti da altri laboratori o collezioni di coltura. Genera curve di crescita dell'ospite rilevando la densità ottica a letture di 730 nanometri a intervalli di tempo regolari da colture infette e non infette.

Le colture pure di microrganismi fotosintetici hanno mostrato morfologie distinte al microscopio ottico. Sulla base delle caratteristiche morfologiche e del sequenziamento dell'rRNA 16S seguito dall'analisi filogenetica, l'isolato è stato identificato come una specie di cianobatteri della famiglia Merismo PDAC. Un isolato alternativo che mostra cellule verdi di forma ovale è indicativo di Synechococcus.

Il ceppo SWII simile a Synechocystis forma prati densi e uniformi su agar BG-11, ideali per saggi di placca basati su piastra. L'infezione da FSBL 14 ha causato la rimozione visibile della placca nei saggi di diluizione seriale della placca del prato e ha impedito la crescita del ceppo SWII in coltura liquida. Le curve di crescita hanno mostrato che la SWII infettata con la sospensione concentrata di phi SBL 14 aveva un aumento molto più lento della densità ottica rispetto sia alla sospensione fagica diluita che al controllo non infetto.

Il tasso di crescita specifico massimo è stato più alto nelle colture SWII non infette. La microscopia elettronica a trasmissione di colture SWII infette ha rivelato effetti citopatici tra cui l'ispessimento della membrana, i granuli interni e il blabbing della membrana, che erano assenti nei controlli non infetti.