Visualizzazione di organoidi retinici a montaggio intero con risoluzione cellulare

Il nostro lavoro si concentra sullo sviluppo e lo studio di organoidi retinici che fungono da modello umano in vitro per studiare come si forma la retina umana, come le malattie influenzano e come potremmo trattarle.

Per far progredire la ricerca nel campo della medicina rigenerativa, utilizziamo organoidi retinici 3D combinati con la pulizia ottica e l'immuno marcatura per visualizzare intere strutture e per studiare la speciale organizzazione delle cellule retiniche con la microscopia confocale.

L'imaging a montaggio completo deve affrontare sfide, come la penetrazione irregolare degli anticorpi nei tessuti densi e l'aberrazione sferica negli organoidi, che causano l'etichettatura della distorsione della superficie e la perdita di messa a fuoco durante la visualizzazione dei tessuti.

Il nostro metodo rivela le connessioni cellulari retiniche, i tipi di cellule, sotto l'organizzazione 3D, fornendo informazioni cruciali sulle cause alla base delle malattie retiniche.

[Istruttore] Per iniziare, ottenere le aliquote di fluorofori disciolte in DMSO anidro, disidratate e congelate. Aggiungere da 1 a 10 microlitri di DMSO a un'aliquota. Ora, combina 50 microlitri di immunoglobulina G secondaria o anticorpo primario, sei microlitri di bicarbonato di sodio molare e da uno a cinque microlitri di fluoroforo e incuba su una piattaforma a dondolo per 40 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Mentre la reazione è in corso, rimuovere i coperchi delle colonne di esclusione dimensionale di purificazione e lasciare passare il tampone. Equilibrare la colonna facendo passare tre cicli da due a tre millilitri di PBS attraverso la colonna. Se l'ultimo equilibrio termina prima della fine dell'incubazione, rimetti i coperchi per evitare che si tirino e attendi che la reazione finisca. Dopo l'incubazione, aggiungere 140 microlitri di PBS alla reazione di marcatura per portare il volume a circa 200 microlitri e agitarlo. Aggiungi la soluzione al centro della colonna e lasciala entrare nella colonna. Dopo che l'ultima goccia è fuoriuscita, spingere la soluzione con 550 microlitri di PBS. Quando il liquido smette di cadere, eluire con 300 microlitri di PBS e raccogliere in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Misurare l'assorbanza del campione a 280 nanometri e alle lunghezze d'onda specifiche del fluoroforo per calcolare la concentrazione di anticorpi e i rapporti di marcatura. Conservare gli anticorpi marcati a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce, per un massimo di sei mesi. Fissare gli organoidi retinici con aldeide paraforme al 4% a temperatura ambiente per 45 minuti. Dopo il fissaggio, aggiungere la soluzione di recupero dell'antigene sugli organoidi e incubare la capsula a 60 gradi Celsius, agitando leggermente a 30 giri al minuto per un'ora. Successivamente, permeabilizzare gli organoidi con PBS contenente l'1% di Triton X-100. Incubare la miscela a temperatura ambiente, agitando leggermente per quattro ore. Ora, bloccare gli organoidi in 2% BSA con Triton X-100 allo 0,1% a temperatura ambiente durante la notte o per più di un giorno. Il giorno successivo, aggiungere gli anticorpi primari diluiti agli organoidi. Incubare a quattro gradi Celsius per due giorni agitando leggermente. Lavare gli organoidi tre volte per 15 minuti ciascuna in soluzione di lavaggio a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Ora, aggiungere la soluzione di diluizione anticorpi secondari e incubare a quattro gradi Celsius per due giorni agitando leggermente. Dopo aver lavato gli organoidi come dimostrato in precedenza, incubare gli organoidi con coloranti fluorescenti diluiti in soluzione di lavaggio a temperatura ambiente per un'ora agitando leggermente. Quindi, lavare di nuovo. Successivamente, preparare soluzioni di 1-propanolo in acqua ultrapura a concentrazioni del 15%, 30%, 45%, 60%, 75% e 90% e regolare ciascuna a pH 9,5 con trimetilammina. Disidratare i campioni in sequenza in gradienti crescenti di soluzioni di 1-propanolo per due ore ciascuna a 30 gradi Celsius con una leggera agitazione. Quindi, trasferire il campione in una soluzione di 1-propanolo al 100% e incubare per una notte a 30 gradi Celsius con una leggera agitazione. Per la chiarificazione del campione, preparare una miscela di alcol benzilico e benzoato di benzile in un rapporto uno a due per ottenere la soluzione BABB. Immergere i campioni in BABB a temperatura ambiente per una notte. Aggiornare la soluzione BABB prima dell'imaging. Con una pipetta di vetro, posizionare l'organoide in una capsula di Petri con fondo di vetro con una goccia di BABB, assicurandosi che tocchi la superficie del vetro di copertura. Ora, è possibile utilizzare un microscopio a scansione laser confocale invertito con obiettivi a basso e alto ingrandimento per acquisire immagini Z-stack per la risoluzione cellulare 3D. Ricalibrare la dimensione del passo dell'acquisizione Z-stack tenendo conto della discrepanza dell'indice di rifrazione tra la soluzione di chiarificazione e il mezzo di immersione. Ora, avvia ImageJ, aggiorna la profondità del voxel selezionando Immagine e facendo clic su Proprietà per creare proiezioni di immagini dello Z-stack. Esamina la profondità dello stack Z selezionando Immagine, quindi Pile e scegliendo Viste ortogonali per visualizzare le viste XY, XZ e YZ dell'organoide retinico. Salva le regioni desiderate facendo clic su File e selezionando Salva con nome. Infine, crea un'animazione del rendering 3D dello Z-stack utilizzando il software di elaborazione. Gli organoidi retinici eliminati con fruttosio glicerolo hanno mostrato il minor miglioramento della trasparenza, ostacolando la visualizzazione del nucleo dell'organoide. La pulizia dell'ECI ha migliorato la visualizzazione degli strati retinici, ma non è ancora riuscita a rivelare il nucleo dell'organoide a causa della persistente diffusione della luce. Gli organoidi chiari Fluoclear BABB hanno mostrato la massima trasparenza, rivelando chiaramente sia la corteccia che il nucleo con fluorescenza costante. Sia gli organoidi chiariti ECI che quelli fluoclear BABB hanno mostrato un restringimento visibile nelle immagini in campo chiaro a causa delle fasi di disidratazione. Il restringimento indotto da BABB ha aumentato la compattezza del campione, consentendo l'uso di obiettivi ad alto ingrandimento per visualizzare strutture più profonde. La marcatura immunologica TUJ1 a 40 giorni in vitro ha mostrato un singolo strato neuronale sottile senza stratificazione visibile. Entro 90 giorni, le cellule popolavano densamente la regione apicale e, a 170 giorni, l'organoide mostrava chiari segni di organizzazione stratificata con una zona apicale definita. A 200 giorni, le proiezioni cellulari allungate si estendevano verso l'interno dalla superficie al nucleo e l'organoide si sviluppava in tre strati retinici distinti a 250 giorni. Le fibre neuronali si estendevano dal centro dell'organoide verso la periferia durante la maturazione, diventando più spesse e più complesse entro 250 giorni in vitro. I fotorecettori a cono che esprimono opsine blu e verdi/rosse sono apparsi in fasi avanzate e hanno mostrato morfologie allungate con punte luminose. I fotorecettori dei bastoncelli che esprimono la rodopsina sono stati identificati dai loro nuclei centrali e dalla distribuzione periferica dell'opsina. Le cellule Chx10-positive sono state inizialmente distribuite ampiamente, ma successivamente localizzate specificamente nello strato nucleare interno durante la maturazione dell'organoide. L'espressione endogena di GCaMP6s è stata preservata dopo la compensazione con BABB, con il segnale GFP rilevabile nella retina neurale dopo fissazione a lungo termine.