Name: Visualizzazione di organoidi retinici a montaggio intero con risoluzione cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Esplora la microscopia confocale a montaggio intero con clearing ottico e immunomarcatura per visualizzare organoidi retinici umani. Questo metodo rivela connessioni neuronali e strati cellulari con risoluzione 3D.

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1. Preparazione di anticorpi secondari fluorescenti su misura
NOTA: Questo approccio funge da alternativa all'uso di anticorpi fluorescenti commerciali (vedere la discussione per i vantaggi della preparazione di anticorpi secondari fluorescenti). Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per coniugare i fluorofori agli anticorpi primari nel caso in cui sia necessario eseguire l'immunofluorescenza diretta e l'anticorpo primario fluorescente non sia disponibile in commercio. Il controllo del rapporto fluoroforo/anticorpo regolando la quantità di fluoroforo nella reazione di marcatura produce anticorpi coniugati più luminosi. Tuttavia, gli anticorpi secondari su misura sono meno stabili e la concentrazione del coniugato risultante è 10 volte inferiore a quella degli anticorpi fluorescenti commerciali. Questo protocollo è adattato dal lavoro descritto da Bálint et al9.
<ol>
	<li>Sciogliere 1 mg di fluoroforo in DMSO anidro e aliquotare in provette per ottenere un finale di 0,02 mg di fluoroforo per provetta. Rimuovere tutto il DMSO utilizzando un concentratore a vuoto di velocità, in funzione per 1 ora e 30 minuti. Conservare le aliquote a -20 ºC al riparo dalla luce. Per Alexa Fluor 405, l'H2O ultrapuro è il solvente appropriato per la produzione di aliquote.</li>
	<li>Per eseguire la reazione di marcatura, sciogliere un'aliquota del fluoroforo in 1-10 μL di DMSO (o H2O ultrapuro per Alexa Fluor 405). NOTA: La quantità esatta di DMSO viene determinata attraverso precedenti test di coniugazione di controllo. Questi test vengono eseguiti quando si deve utilizzare un nuovo lotto di un fluoroforo (o quando si esaurisce un precedente lotto di fluoroforo) o quando un nuovo fluoroforo viene utilizzato per la prima volta nella coniugazione. Il test di coniugazione di controllo prevede l'esecuzione di reazioni di marcatura con quantità variabili di fluoroforo per determinare il rapporto ottimale fluoroforo/anticorpo nel coniugato. Nel nostro caso, il rapporto ottimale è tipicamente compreso tra 3 μl e 5 μl.</li>
	<li>Incubare 50 μL di IgG secondarie (o primarie), 6 μL di 1 M NaHCO3 e 1-5 μL di fluoroforo per 40 minuti a temperatura ambiente (RT) su una piattaforma oscillante, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Mentre la reazione è in corso, preparare le colonne di esclusione dimensionale di purificazione rimuovendo i coperchi e lasciando passare il tampone. Equilibrare la colonna (una per ogni reazione di marcatura) facendo scorrere 3 x 2-3 mL di PBS attraverso la colonna. Nel caso in cui l'ultima fase di equilibratura finisca prima della fine dell'incubazione, riposizionare i coperchi per evitare che si secchino e attendere che la reazione di marcatura finisca. NOTA: Le colonne di esclusione dimensionale di purificazione funzionano per gravità. Assicurarsi che la colonna non si asciughi in nessun momento, altrimenti la reazione di purificazione non funzionerà correttamente.</li>
	<li>Al termine della reazione (passaggio 1.3), aggiungere 140 μL di PBS alla reazione di marcatura per rendere il volume di circa 200 μL e vorticarlo. Aggiungere questa soluzione al centro della colonna, lasciare che il campione entri nella colonna e, dopo che l'ultima goccia è stata eluita, spingere aggiungendo 550 μl di PBS. Quando il liquido smette di cadere, eluire aggiungendo 300 μL di PBS e raccogliere in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di anticorpi e i rapporti di marcatura misurando l'assorbanza del campione a 280 nm e l'assorbanza dei fluorofori utilizzati. Applicare la legge di Beer-Lambert per determinare la concentrazione (in molarità) come segue: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> Dove A sta per l'assorbanza, ε per il coefficiente di estinzione molare e CF280 è una misura dell'assorbanza che il fluoroforo specifico ha a 280 nm che funge da fattore di correzione. Quindi, la concentrazione dell'anticorpo è: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> E il rapporto di etichettatura è: 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq3.jpg"></li>
	<li>Conservare gli anticorpi marcati a 4 ºC, al riparo dalla luce, per un massimo di 6 mesi.</li>
</ol>
2. Marcatura in immunofluorescenza
<ol>
	<li>Fissare gli organoidi con paraformaldeide (PFA) al 4% a RT per 45 minuti. NOTA: FACOLTATIVO: Incubare gli organoidi con una soluzione di recupero dell'antigene (fasi 2.2 e 2.3) per migliorare l'immunoreattività degli antigeni.</li>
	<li>Preparare 40 mL di soluzione per il recupero dell'antigene mescolando 0,117 mg di citrato di sodio tribasico diidrato in H2O ultrapuro e regolare a pH 9.</li>
	<li>Incubare gli organoidi con la soluzione di recupero dell'antigene agitando lievemente (30 giri/min) a 60 °C per 1 ora.</li>
	<li>Permeabilizzare gli organoidi con PBST (PBS con Triton X-100 all'1%) agitando leggermente a RT per 4 ore.</li>
	<li>Bloccare gli organoidi con una soluzione bloccante (albumina sierica bovina (BSA) al 2% con Triton X-100 allo 0,1%) a RT per una notte (o per 1 giorno). NOTA: Le concentrazioni di anticorpi primari e secondari dipendono dall'anticorpo specifico. Per l'immunofluorescenza di campioni a montaggio intero, utilizziamo una concentrazione più elevata rispetto ai campioni sezionati. Incubiamo l'anticorpo primario a 10 μg/mL che, nella maggior parte dei casi, corrisponde a 1:100 dal magazzino (Tabella 1). Incubiamo i nostri anticorpi secondari su misura a 20-50 μg/mL.</li>
	<li>Incubare gli organoidi con gli anticorpi primari diluiti in soluzione di lavaggio (0,1% BSA con 0,1% Triton X-100) a 4 °C per 2 giorni agitando leggermente.</li>
	<li>Lavare gli organoidi per 3 x 15 minuti in soluzione di lavaggio agitando leggermente a RT.</li>
	<li>Incubare gli organoidi con gli anticorpi secondari diluiti in soluzione di lavaggio a 4 °C per 2 giorni agitando leggermente.</li>
	<li>Lavare gli organoidi per 3 x 15 minuti in soluzione di lavaggio agitando leggermente a RT. NOTA: Dopo l'immunomarcatura, i coloranti fluorescenti di scelta possono essere incubati. Normalmente utilizziamo marcatori di nuclei fluorescenti, come DAPI (1:1.000) e DRAQ5 (1:500), o falloidina (1:100) per visualizzare la rete di filamenti di actina.</li>
	<li>Incubare gli organoidi con i coloranti fluorescenti diluiti in soluzione di lavaggio a RT per 1 ora agitando leggermente.</li>
	<li>Lavare gli organoidi per 3 x 15 minuti in soluzione di lavaggio agitando leggermente a RT.</li>
</ol>
3. Pulizia ottica con FluoClear BABB
NOTA: L'1-propanolo potrebbe compromettere i contenitori di plastica, in particolare per l'esposizione a lungo termine. Per sicurezza, usa contenitori di vetro.
<ol>
	<li>Fase di disidratazione<ol>
		<li>Preparare soluzioni di 1-propanolo in H2O ultrapuro alle percentuali indicate (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) e quindi regolare a pH 9,5 con trimetilammina. ATTENZIONE: La trietilammina è tossica se inalata. Lavorare sotto una cappa aspirante. Le soluzioni possono essere riutilizzate se conservate correttamente (contenitore ben sigillato). Regolare il pH prima dell'uso.</li>
		<li>Incubare i campioni con il gradiente crescente di soluzioni di 1-propanolo (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) per 2 ore ciascuno a 30 °C con lieve agitazione.</li>
		<li>Incubare i campioni con 100% 1-propanolo per una notte a 30 °C con una leggera agitazione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Passaggio di compensazione ATTENZIONE: BABB è una potente miscela di solventi nota per la sua capacità di dissolvere o danneggiare in modo significativo molte materie plastiche. Per sicurezza, utilizzare contenitori di vetro con coperchi compatibili e lavorare all'interno di una cappa aspirante.<ol>
		<li>Preparare il BABB mescolando l'alcol benzilico (BA) e il benzoato di benzile (BB) in un rapporto 1:2.</li>
		<li>Immergere i campioni in BABB a RT durante la notte.</li>
		<li>Prima dell'imaging, aggiornare il BABB. NOTA: Per organoidi di ~1 mm di diametro, BABB induce un effetto di chiarificazione che è evidente in decine di minuti. A seconda delle dimensioni e della natura del campione, il grado di chiarificazione potrebbe essere diverso e/o richiedere un tempo di esposizione più lungo alla soluzione di chiarifica. Si consiglia di acquisire immagini prima e dopo l'immersione BABB per migliorare il protocollo di chiarificazione.</li>
		<li>Conservare i campioni chiariti BABB con la soluzione BABB a lungo termine a 4 °C. Proteggere dalla luce per preservare la fluorescenza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Acquisizione di immagini a montaggio intero
<ol>
	<li>Utilizzando una pipetta di vetro, posizionare l'organoide in una capsula di Petri con fondo di vetro con una goccia di BABB. Assicurarsi che il campione entri in contatto con la superficie del vetro di copertura. ATTENZIONE: Fare attenzione che la goccia di BABB contenente il campione non entri in contatto con i bordi in plastica del piatto, altrimenti scioglierà la plastica, compromettendo il campione e la qualità dell'imaging.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio a scansione laser confocale invertito dotato di obiettivi a basso e alto ingrandimento, è possibile acquisire immagini Z-stack per ottenere una visione 3D completa del campione con dettagli cellulari. NOTA: Per questo studio sono stati utilizzati un obiettivo ad aria con apertura numerica (NA) 10x e un obiettivo NA 1.4 63x, con una dimensione del passo rispettivamente di 3,5 μm e 1 μm.</li>
</ol>
5. Elaborazione delle immagini
<ol>
	<li>Ricalibrare la dimensione del passo dell'acquisizione Z-stack considerando la mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI) tra la soluzione di chiarificazione e il mezzo di immersione.<ol>
		<li>Calcolare la dimensione del passo ricalibrata come segue: 
		<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq4.jpg"> Per un campione incorporato in BABB, ripreso con un obiettivo ad aria con una dimensione del passo di 3,5 μm, sarà il seguente: 
		<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"></li>
		<li>Utilizzando ImageJ, modificare la profondità del voxel (fare clic su Immagine | Proprietà...) per la dimensione del passo ricalcolata.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crea proiezioni di immagini dello Z-stack.<ol>
		<li>Utilizzando ImageJ, ispezionare in profondità lo Z-stack (fare clic su Immagine | Pile | Viste ortogonali). Appariranno le viste XY, XZ e YZ dell'organoide retinico.</li>
		<li>Salvare le regioni di interesse desiderate (fare clic su File | Salva con nome...).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crea un'animazione del rendering 3D dello Z-stack utilizzando il software di elaborazione (vedi la Tabella dei Materiali).<ol>
		<li>Selezionare i canali da visualizzare abilitando le relative caselle di controllo.</li>
		<li>Regolare i piani Z per visualizzare l'interno del campione (abilitare Clipping nella casella di controllo).</li>
		<li>Registra l'animazione utilizzando l'editor di filmati (abilita Editor di filmati nella casella di controllo). Trascina e rilascia e ingrandisci e rimpicciolisci direttamente usando il mouse. Fare clic su Aggiungi per includere una clip diversa per l'animazione. Se si regolano i piani Z, abilitare l'opzione Clip piani ( fare clic su Impostazioni... | selezionare la casella Ritaglia piani ).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Obiettivo 10x NA0.40 DRY</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>Obiettivo OLIO 63x NA1.40</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>-</td></tr><tr><td>Alcool benzilico (BA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13162</td><td>-</td></tr><tr><td>Benzoato di benzile (BB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W213802</td><td>-</td></tr><tr><td>piastra di Petri in vetro inferiore</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>-</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Codice: A7030</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorpo Chx10</td><td>Sta Cruz Biotech</td><td>SC-365519</td><td>-</td></tr><tr><td>Colonne di filtrazione su gel Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17-0853-02</td><td>-</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>-</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>-</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermofisher</td><td>62251</td><td>-</td></tr><tr><td>Colorante (acido carbossilico, estere succinimidilico)</td><td>Invitrogen o Abberior</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ImmagineJ/Figi&nbsp;</td><td>NIH</td><td>&nbsp; v1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser invertito</td><td>Microsistemi Leica</td><td>TCS SP8 STED 3X-FALCON</td><td>-</td></tr><tr><td>Software di elaborazione 3D LAS X</td><td>Microsistemi Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>mQ H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>Acqua ultrapura dal sistema di depurazione dell'acqua Synergy</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Organics</td><td>424270010</td><td>-</td></tr><tr><td>IgG secondarie non marcate</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorpo blu Opsina</td><td>Milliporo&nbsp; &nbsp;</td><td>AB5407&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorpo Opsina RG</td><td>Millipore</td><td>AB5745&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA) 4%</td><td>Termo scientifico&nbsp;</td><td>J199943-K2</td><td>-</td></tr><tr><td>Soluzione PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>-</td></tr><tr><td>Sonde per marcatura falloidina</td><td>Thermofisher</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorpo RECOV</td><td>Millipore</td><td>AB5585-I&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorpo RHO (RET-P1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O4886&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Citrato di sodio tribasico diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Visualizzazione del materiale C8532</td><td>-</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorpo TUJ1</td><td>Covance&nbsp;</td><td>MMS-435P&nbsp;</td><td>-</td></tr></tbody></table>

visualizzazione di organoidi retinici a montaggio intero con risoluzione cellulare

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

Visualizzazione di organoidi retinici a montaggio intero con risoluzione cellulare

Retinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells are intricate 3D structures that mimic the human retina, offering a powerful platform ...

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In questo articolo video dimostra la creazione di organotipica culture retina wholemount cytospin e una procedura per l'analisi di esogenamente effetti indotti. Organotipica culture retina wholemount imitare...

In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

L'intera struttura 3D e il contenuto cellulare degli organoidi, così come la loro somiglianza fenotipica con il tessuto originale possono essere catturati utilizzando il protocollo di imaging 3D a risoluzione singola descritto qui. Questo protocollo può essere applicato a una vasta gamma di organoidi che variano in origine, dimensione e forma.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Qui viene presentata una tecnica chirurgica per il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nello spazio sottoretinico di un grande modello animale.

Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

Questo studio mira a sviluppare un nuovo modello di coltura retinica organotipica umana (HORC) che impedisce di compromettere l'integrità retinica durante la manipolazione dell'espianto. Ciò si ottiene coltivando la retina con il vitreo sovrastante e il pigmento retinico sottostante epitelio-coroide (RPE-coroide) e sclera.

Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana

Utilizzando un metodo auto-organizzante, sviluppiamo un protocollo con l'aggiunta di COCO che potrebbe aumentare significativamente la generazione di fotorecettori.

Induzione diretta di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti umane

Qui descriviamo un sistema di induzione organoide retinica ottimizzato, adatto a varie linee di cellule staminali pluripotenti umane per generare tessuti retinici con elevata riproducibilità ed efficienza.

Sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per differenziare le hiPSC in cluster di campi oculari e generare organoidi neuro-retinici utilizzando condizioni di coltura semplificate che coinvolgono sia sistemi di coltura aderenti che in sospensione. Altri tipi di cellule oculari, come l'RPE e l'epitelio corneale, possono anche essere isolati dai campi oculari maturi nelle colture retiniche.

Generazione di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo sane e specifiche per malattie retiniche

Questo protocollo fornisce una procedura di preparazione ottimizzata ed elaborata per campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione. È adatto per applicazioni che prevedono l'analisi delle sinapsi in organoidi retinici maturi.

Preparazione di campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione

Le microglia sono cellule immunitarie uniche residenti nella retina, che svolgono un ruolo cruciale in varie malattie degenerative della retina. La generazione di un modello di co-coltura di organoidi retinici con microglia può facilitare una migliore comprensione della patogenesi e del progresso dello sviluppo delle malattie retiniche.

Assemblaggio di organoidi retinici con microglia

La retina mostra una complessa organizzazione spaziale attraverso la sua struttura laminare. Le moderne tecniche di trascrittomica spaziale e sequenziamento richiedono sezioni di tessuto &lt; 20 μm di spessore, limitandone l'applicabilità nella ricerca retinica. Questo metodo di criosezione appena congelato produce sottili sezioni en face della retina di topo preservando le relazioni spaziali planari, consentendo una mappatura molecolare completa tra le lamine.

En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Esplora la microscopia confocale a montaggio intero con clearing ottico e immunomarcatura per visualizzare organoidi retinici umani. Questo metodo rivela connessioni neuronali e strati cellulari con risoluzione 3D.

Visualizzazione di organoidi retinici a montaggio intero con risoluzione cellulare

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