Produzione di un sistema di particelle simile al virus SARS-CoV-2 per studiare i cicli di vita virali in vitro

Presentiamo un protocollo in vitro ottimizzato per la produzione di particelle simili al virus SARS-CoV-2 che imitano da vicino il virus autentico. Questo approccio consente lo studio dell'infezione virale, dell'assemblaggio e dei meccanismi di uscita senza i vincoli di richiedere un laboratorio di biosicurezza di livello 3.

La nostra ricerca si concentra sulla comprensione della biologia del virus SARS-CoV-2 e cerca di trovare farmaci, in particolare dalla medicina cinese contro SARS-CoV-2. Tutti gli studi sul virus SARS-CoV-2 devono essere controllati in un laboratorio di livello di biosicurezza tre. E questa limitazione sperimentale rende uno studio sul SARS-CoV-2 fattibile solo in una manciata di vite. Il virus SARS-CoV-2 come metodo pratico dello studio su SARS-CoV-2 possibile senza limitazioni di laboratorio di livello tre di biosicurezza, e l'elenco sarà un metodo molto utile.

[Istruttore] Per iniziare, seminare circa 3 milioni di cellule HEK-293T in una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri di diametro con terreno completo DMEM, integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per circa 24 ore. Controllare la cofluenza cellulare al microscopio. Diluire 60 microlitri di PEI da una soluzione madre da un milligrammo per millilitro con terreno privo di siero per raggiungere un volume finale di 200 microlitri. Ora, prendi 200 microlitri di terreno privo di siero e aggiungi 6,7 microgrammi di plasmide N, 10 microgrammi di plasmide Luc-T20, 0,016 microgrammi di plasmide S e 3,3 microgrammi di plasmide M-IRES-E. Aggiungere delicatamente la soluzione di PEI diluita nella soluzione contenente plasmidi che rivestono le proteine della struttura virale e incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti. Questa è la soluzione di trasfezione. Far cadere con cautela la soluzione di trasfezione sulle cellule HEK-293T e agitare delicatamente la piastra di coltura tissutale per garantire una miscelazione accurata. Sostituire il terreno di coltura cellulare con il terreno completo DMEM sei ore dopo l'infezione e incubare le cellule HEK-293T trasfettate a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48 ore. Raccogli il surnatante delle cellule HEK-293T infette, che contiene le particelle simili al virus SARS-CoV-2. Filtrare il surnatante raccolto attraverso un filtro a siringa da 0,45 micrometri per rimuovere i detriti cellulari. Questo è il mezzo SC2-VLP. Seminare 40.000 cellule HEK-293T con espressione stabile dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2, o ACE2, e TMPRSS2 in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 50 microlitri di terreno SC2-VLP. Incubare la piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e lavare una volta con 100 microlitri di PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius. Lisare le cellule HEK-293T seminate con cellule ACE2 TMPRSS2 con 20 microlitri di tampone di lisi passiva e far oscillare delicatamente il campione su un agitatore orbitale per 15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 4.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius utilizzando una centrifuga per micropiastre refrigerata, quindi trasferire immediatamente la piastra in un bagno di ghiaccio. Prelevare 100 microlitri di tampone per il saggio della luciferasi ricostituita in una nuova piastra bianca opaca a 96 pozzetti e aggiungere 20 microlitri di lisato in ciascun pozzetto. Mescolare brevemente pipettando su e giù due o tre volte. Misurare il segnale di luminescenza utilizzando un lettore di piastre. Successivamente, per valutare la composizione del terreno SC2-VLP, aggiungere 1,36 millilitri di soluzione PEG 8000 a 10 millilitri di terreno SC2-VLP. Mettere il composto su uno shaker orbitale e mescolare lentamente a quattro gradi Celsius durante la notte. Centrifugare la soluzione a quattro gradi Celsius e 2.000 G per 30 minuti. E raccogliere il pellet SC2-VLP per l'analisi del western blotting. Seminare circa 3 milioni di cellule HEK-293T in modo uniforme in una piastra di coltura con fondo di vetro con un diametro di 15 millimetri e lasciare che le cellule aderiscano e crescano fino a raggiungere circa il 70% di confluenza. Dopo aver sezionato le cellule, come dimostrato in precedenza con le quantità di plasmidi modificate, lavare delicatamente la piastra di coltura due volte con un millilitro di PBS ghiacciato. Aggiungere un millilitro di soluzione di fissazione dell'aldeide paraforme al 4% a temperatura ambiente e incubare per 15 minuti. Lavare le cellule due volte per cinque minuti ciascuna con un millilitro di PBS a temperatura ambiente e permeabilizzare le cellule aggiungendo un millilitro di Triton X-100 allo 0,25% per 10 minuti. Anche in questo caso, lavare le celle due volte per cinque minuti ciascuna con un millilitro di PBS a temperatura ambiente. Quindi aggiungere un millilitro di albumina sierica bovina al 5% per un'ora per bloccare le interazioni anticorpali non specifiche. Aggiungere circa 200 microlitri di soluzione di anticorpi primari per coprire il fondo del vetro e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Quindi, rimuovere la soluzione di anticorpi primari e lavare le cellule tre volte per cinque minuti ciascuna con un millilitro di PBS a temperatura ambiente. A questo punto, aggiungere una soluzione di anticorpi secondari coniugati a fluorescenza e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Dopo aver lavato le cellule tre volte con PBS, colorare i nuclei con 2,5 microgrammi per millilitro di soluzione di Hoechst a temperatura ambiente per cinque minuti. Infine, dopo aver lavato le cellule con PBS, osservare la colorazione della proteina S o dell'organello prima di acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale. Questa figura illustra la sensibilità della produzione di SC2-VLP al variare delle quantità di trasfezione del plasmide che codifica per la proteina spike. Il titolo SC2-VLP era più alto quando venivano trasfettati 0,016 microgrammi di plasmide S e diminuiva significativamente con 0,16 e 1,6 microgrammi di plasmide S. La mutazione da H1271 a E nella proteina spike ha ridotto significativamente il titolo di SC2-VLP rispetto al wild-type. La mutazione da E1262 a H ha portato ad una moderata riduzione del titolo SC2-VLP, mentre la doppia mutazione da E1262 a H, da H1271 a E ha abolito completamente la produzione. Le bande proteiche S e S-2 a lunghezza completa sono diminuite nelle corsie da E1262 a H e doppie mutanti, rispetto al wild-type. L'efficienza dell'impacchettamento S è stata ridotta anche nei mutanti E1262 in H e da H1271 in E e quasi abolita nel doppio mutante. L'abbondanza di VLP è rimasta sostanzialmente invariata tra i mutanti wild-type e tutti i mutanti S. La proteina S wild-type è colocalizzata con il marcatore cis-Golgi GM130, ma non con il marcatore ER Sec61 beta o il marcatore ERGIC ERGIC 53. La proteina S mutante da H1271 a E mostrava una distribuzione citoplasmatica diffusa e mancava di colocalizzazione con GM130.