Una guida passo passo all'isolamento e all'analisi della superficie fogliare e dell'RNA apoplastico utilizzando le rosette di Arabidopsis

Stiamo cercando di capire come le piante regolano i loro microbiomi e se gli RNA secreti dalle piante regolano l'espressione genica sia nei microbi procariotici che eucariotici che colonizzano le piante. Utilizziamo una combinazione di elettroforesi a conchiglia ad alta risoluzione e analisi basate su Illumina per valutare gli RNA presenti sulla superficie fogliare e come cambiano in risposta allo stress biotico. Mentre studi recenti suggeriscono che gli RNA extracellulari sono assorbiti da patogeni fungini e batterici, i meccanismi alla base dell'assorbimento dell'RNA e le conseguenze funzionali di questo assorbimento rimangono in gran parte inesplorati.

Per iniziare, prendi piante di arabidopsis di sei o sette settimane per ogni replica. Aggiungere silhouette L-77 al VIB sterile, prima di iniziare l'isolamento del lavaggio della superficie fogliare. Quindi, utilizzando un cilindro graduato, trasferire 100 millilitri della soluzione VIB preparata in un flacone spray da 500 millilitri.

Usando le forbici sottili, stacca con cura le rosette di arabidopsis dalle loro radici. Dopodiché, usa una spazzola morbida per rimuovere lo sporco in eccesso dai petali. Posizionare le rosette staccate su un vassoio piatto con la superficie abassiale rivolta verso l'alto.

Quindi spruzzare la superficie abassiale utilizzando cinque pompe del flacone spray riempito con VIB e agente umettante. Capovolgere con cautela le rosette e spruzzare la superficie adassiale. Preparare siringhe modificate con fori sul fondo avvolgendole con una pellicola di para intorno al collo per sospendere la punta sopra il fondo del flacone.

Per recuperare il lavaggio della superficie fogliare, inserire delicatamente le rosette spruzzate nelle siringhe modificate senza ago da 60 millilitri poste all'interno di flaconi da centrifuga da 250 millilitri e spruzzare due dosi di tampone nella siringa. Quindi centrifugare le bottiglie caricate a 100 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Filtrare ora la superficie fogliare recuperata attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 50 millilitri, tenuta in ghiaccio.

Per il metodo del tampone sulla superficie fogliare, spruzzare le rosette staccate con la soluzione di VIB e agente umettante nello stesso modo descritto nel passaggio precedente. Per recuperare il tampone della superficie fogliare, utilizzare bastoncini di cotone sterile per tamponare sia la superficie adassiale che quella abassiale delle rosette. Quindi premere le punte imbevute contro la parete interna di una provetta da centrifuga da 15 millilitri per estrarre il liquido.

Filtrare il campione di tampone superficiale fogliare estratto, attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri, in una provetta da due millilitri posta sul ghiaccio. Metti lo stesso set di piante precedentemente utilizzate per il lavaggio della superficie fogliare o l'isolamento del tampone in un becher pulito e sciacquale delicatamente due volte con acqua distillata. Per infiltrare le rosette con VIB nell'aspirapolvere, posizionare con cura le rosette risciacquate in una caffettiera francese contenente da 300 a 500 millilitri di VIB.

Chiudere il coperchio e abbassare delicatamente lo stantuffo fino a quando le rosette non sono completamente sommerse. Inserire la pressa francese in una camera a vuoto e applicare il vuoto per 20 secondi utilizzando una pompa a vuoto fino a quando le piante non sono ben infiltrate. Dopo aver rilasciato il vuoto, rimuovere la pressa francese dalla camera e togliere il coperchio.

Versare il VIB in un becher di plastica da 500 millilitri e rimuovere le rosette. Quindi scuotere delicatamente le rosette e spennellare le foglie su un tovagliolo di carta per rimuovere il tampone in eccesso. Ora usando la carta assorbente, tampona delicatamente le superfici delle foglie per rimuovere eventuali residui di tampone.

Per raccogliere il liquido di lavaggio aplastico, inserire le rosette infiltrate in VIB in siringhe senza ago da 60 millilitri, poste all'interno di flaconi da centrifuga da 250 millilitri come fatto in precedenza. Centrifugare le bottiglie a 600 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius con una lenta accelerazione. Quindi filtrare il liquido di lavaggio aplastico in pool attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri in un tubo da 15 millilitri posto sul ghiaccio.

Prepara o acquista un mini gel contenente il 10 o il 15% di poliacrilammide e sette molari di urea in tampone EDTA di acido trisborarico, utilizzando una soluzione di acrilammide e bis. Quindi mescolare i campioni di RNA con un tampone di caricamento denaturante due volte. Scaldare il composto a 65 gradi Celsius per cinque minuti e metterlo immediatamente sul ghiaccio.

Ora risolvi i campioni di RNA in un tampone di 0,5 volte TBE a temperatura ambiente applicando 220 volt per circa un'ora e 15 minuti. Quindi colorare il gel con la colorazione in gel di acido nucleico cyber gold in 0,5 volte TBE per 10 minuti. Sciacquare il gel due volte con acqua distillata e visualizzarlo, utilizzando un sistema di imaging.

Per quantificare le bande di RNA risolte, utilizzare il metodo di analisi su gel dalla documentazione dell'immagine J nel menu di analisi e analisi su gel. Preparare gli standard di RNA per due repliche tecniche diluendo l'RNA del lisato cellulare in RNasi e acqua priva di DNasi. Per preparare 1,5 volte la colorazione in gel di acido nucleico cyber gold, scioglierla in un tampone tris HCL da 500 millimolari a pH otto.

Per l'installazione della micropiastra, aggiungere 99 microlitri di acqua distillata a ciascun pozzetto. Quindi, aggiungere un microlitro di RNA a ciascun pozzetto utilizzando lo stesso volume sia per i campioni di RNA che per gli standard. Infine, aggiungi 50 microlitri di soluzione di cyber gold a ciascun pozzetto.

Per impostare i parametri del lettore di micropiastre, scegliere l'agitazione lineare o orbitale per tre secondi. Impostare il lettore di micropiastre in modalità punto finale di fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 496 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 540 nanometri. Costruire una linea di calibrazione, utilizzando i valori di intensità della fluorescenza degli standard di RNA.

L'analisi del gel di RNA denaturante ha rivelato che sia i campioni di lavaggio della superficie fogliare che quelli di liquido di lavaggio aplastico contengono un'ampia gamma di dimensioni di RNA, comprese specie di RNA lunghe e piccole. Le quantità totali di RNA isolate dal liquido di lavaggio aplastico e dal lavaggio della superficie fogliare erano simili, quando normalizzate al peso fresco della pianta. I profili di RNA del lavaggio della superficie fogliare, del lavaggio aplastico e del lisato cellulare differiscono notevolmente, confermando una minima contaminazione intracellulare dell'RNA e dimostrando che l'RNA aplastico è altamente processato con bande diffuse a basso peso molecolare L'aggiunta dello 0,001% di L-77 al tampone di isolamento della vescicola ha quasi raddoppiato la resa di RNA dalle superfici fogliari rispetto al tampone senza l'agente umettante .

Ma l'aumento di questa concentrazione allo 0,01% non ha ulteriormente migliorato il recupero dell'RNA. Un secondo lavaggio delle stesse foglie ha recuperato circa il 63% dell'RNA ottenuto nel primo lavaggio, indicando una secrezione continua di RNA sulla superficie fogliare. La quantificazione dell'RNA, utilizzando saggi su piastra per microtitolazione basati sulla fluorescenza, ha dimostrato un'elevata linearità con la concentrazione di RNA sia per il cyber gold che per i metodi di rilevamento RIBO 488.

Abbiamo dimostrato che i tRNA e i frammenti derivati da tRNA, o TDR, sono particolarmente abbondanti nell'RNA extracellulare, probabilmente a causa della loro resistenza alla degradazione. Quindi crediamo che questi TDR probabilmente regolano l'espressione genica nei batteri. Desideriamo identificare le fonti cellulari dell'RNA della superficie fogliare e i ruoli biologici che questa RNasi della superficie fogliare potrebbe svolgere nel contesto delle interazioni microbiche pianificate.