Estrazione di acidi desossiribonucleici a genoma intero da specie di Mycobacterium tramite la tecnica del bromuro di cetiltrimetilammonio
12 dicembre 2025
Questo protocollo descrive il metodo CTAB per estrarre DNA di alta qualità dai micobatteri, superando le difficoltà poste dalle loro dure pareti cellulari ricche di acido micolico. Il processo prevede la digestione enzimatica, la lisi cellulare con CTAB e la purificazione del DNA tramite estrazione organica e precipitazione di etanolo. Questo metodo produce DNA adatto agli studi molecolari ed è affidabile per la ricerca micobatterica.
La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione genetica delle specie micobatteriche e sulla natura complessa delle malattie micobatteriche nell'uomo. Diamo particolare enfasi ai micobatteri non tubercolosi e alle loro interazioni con i macrofagi durante la coinfezione con altre specie, in particolare i microbatteri tubercolosi. Inoltre, ci concentriamo sulla speciazione di micobatteri patogeni, sull'identificazione di geni associati alla virulenza e sul polimorfismo a singolo nucleotide legato alla resistenza ai farmaci.
A causa della parete cellulare spessa, lipidica e idrofobica delle micobatteriche, l'estrazione del DNA è stata difficile e richiede tecniche specializzate di lisi per scomporle e rilasciare efficacemente il DNA genomico. Nel nostro protocollo, stiamo affrontando l'estrazione del DNA da specie di micobatteri utilizzando il metodo CTAB come metodo robusto ed efficace per produrre DNA di alta qualità, adatto a tutte le tecniche di sequenziamento genomico e ad altre tecniche molecolari. Per cominciare, uccidere termicamente la coltura liquida prelevata in un tubo da 15 millilitri a 80 gradi Celsius per un'ora.
Poi metti il tubo da 15 millilitri nella centrifuga e fai girare a 3, 220 G per 15-30 minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta sterile, scartare il supernatant trasparente, assicurandosi che tutto il materiale sia rimosso. Sospendere accuratamente il pellet di coltura in 300 microlitri di tampone Tris-EDTA e trasferire il pellet sospeso in un tubo da 2 millilitri.
Ora, aggiungi 100 microlitri di soluzione di lisozima a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro nel tubo e mescola pipettando su e giù cinque volte. Tocca delicatamente il tubo per garantire una dispersione uniforme e posiziona il tubo in un incubatore rotativo a 37 gradi Celsius, incubando durante la notte. Il giorno seguente, preparare una miscela di 5 microlitri di proteinasi K a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro e 70 microlitri di SDS al 10%.
Aggiungi 75 microlitri di questa miscela a ciascun campione. Mescola il campione battendo il tubo e incuba a 65 gradi Celsius per 10 minuti, invertendo o tamponando il tubo a intermittenza per mescolare. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di cloruro di sodio da 5 molari al campione, seguiti da 100 microlitri di soluzione di cloruro di sodio CTAB preriscaldata a una temperatura di 65 gradi Celsius sul campione.
Mescola il campione picchiettando finché la soluzione non diventa lattiginosa. Inserire il tubo in un incubatore a 65 gradi Celsius per 10 minuti, invertendo o tamponando intermittentemente il tubo per mescolare. Ora, aggiungi un volume uguale, circa 675 microlitri di soluzione di cloroformio isoamilico alcolico in un rapporto di 24:1 rispetto al campione e mescola tramite picchiettatura.
Mettere il campione in una centrifuga e far ruotare a 12.000 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Poi, utilizzando una pipetta, aspirare con cura tra 550 e 600 microlitri della fase acquosa superiore in tubi sterili da 1,5 millilitri e etichettarli in modo appropriato. Aggiungi 550-600 microlitri di isopropanolo ghiacciato a ogni tubo e mescola il contenuto invertendo il tubo più volte.
Metti il tubo in un congelatore a 20 gradi Celsius e incuba per 30 minuti fino a un'ora. Successivamente, centrifugare il tubo alla massima velocità, circa 21, 130 G per 30 minuti a temperatura ambiente per mettere in pellet il DNA insolubile. Usando una pipetta, aspira il surnante dal lato anteriore del tubo senza disturbare la pellet di DNA.
Ora, aggiungi 1.000 microlitri di etanolo al 75% freddo al pellet e mescola il campione invertendo il tubo più volte. Centrifugare il campione a 12.000 G per 30 minuti nella stessa orientazione precedente. Dopo la centrifugazione, aspirare o decantare tutto l'etanolo senza disturbare il pellet.
Lascia asciugare il tubo all'aria a temperatura ambiente durante la notte o per almeno 30 minuti. Poi, aggiungi tra 25 e 50 microlitri di Tampone Tris-EDTA a pH 8 per risospendere il DNA, e posiziona il tubo a 4 gradi Celsius durante la notte. Dopo la valutazione del controllo qualità, metti il tubo in un congelatore impostato a 80 gradi Celsius per una conservazione a lungo termine.
La resa di DNA ottenuta con il metodo di estrazione CTAB variava tra 190 nanogrammi per microlitro e 600 nanogrammi per microlitro. Il rapporto di assorbenza 260/280 variava tra 1,9 e 2,0, mentre quello 260/230 variava tra 1,8 e 2,2, indicando DNA di alta purezza. Un singolo picco di assorbenza è stato rilevato a 260 nanometri.
L'elettroforesi su gel di agarosio su campioni di alta qualità ha mostrato una banda di DNA di alto peso molecolare intatta distinta con degradazione minima. In alcune specie di mycobacterium non tubercolosi, la resa di DNA era inferiore a 50 nanogrammi per microlitro e i rapporti di purezza scendevano sotto l'intervallo ideale, indicando una contaminazione.
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Panoramica
Questo studio affronta le sfide legate all'estrazione di DNA di alta qualità da micobatteri, in particolare a causa delle loro pareti cellulari robuste composte da acidi micolici. Il risultato principale è il metodo CTAB, che produce efficacemente DNA adatto a diverse analisi molecolari.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Caratterizzazione genetica dei micobatteri
- Malattie micobatteriche e interazioni nelle co-infezioni
- Speciazione patogena e resistenza ai farmaci
Sfondo
- Le micobatteri hanno pareti cellulari strutturalmente complesse e resistenti, il che complica l'estrazione del DNA.
- Concentrarsi sui micobatteri non tubercolari e sul loro rapporto con la tubercolosi.
- Sfide incontrate nell'estrazione del DNA a causa delle pareti cellulari ricche di lipidi.
Metodi Utilizzati
- Metodo CTAB per l'estrazione del DNA
- Specie di micobatteri come sistema biologico
- Tecniche di digestione enzimatica ed estrazione organica
Risultati principali
- Il rendimento di DNA è variato da 190 a 600 nanogrammi per microlitro con rapporti di purezza elevati.
- Visualizzazione di DNA ad alto peso molecolare e integro mediante elettroforesi su gel.
- Alcune specie hanno fornito quantità inferiori di DNA, indicando variazioni nell'efficienza di estrazione.
Conclusioni
- Lo studio stabilisce un metodo affidabile per l'estrazione di DNA di alta qualità da micobatteri.
- Questa metodologia aumenta il potenziale per ulteriori ricerche sulla genetica e sulle malattie dei micobatteri.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'estrazione affidabile di DNA genomico ad alta purezza da micobatteri è fondamentale per la caratterizzazione molecolare, il profilo di resistenza e le analisi genomiche successive nella ricerca sulle malattie infettive. La tecnica CTAB affronta le sfide uniche poste dalla parete cellulare dei micobatteri, consentendo una preparazione robusta del campione per il sequenziamento e la diagnostica molecolare. Questa capacità supporta la ricerca traslazionale e le decisioni strategiche nel campo della genomica dei patogeni e della sorveglianza della resistenza ai farmaci.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente l'analisi genetica di specie micobatteriche per l'identificazione e la validazione di bersagli.
- Permette il rilevamento di geni associati alla virulenza e di SNP legati alla resistenza, per una valutazione meccanicistica dei rischi.
- Facilita un profilo molecolare ad alta affidabilità per guidare la selezione precoce del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce input di DNA di alta qualità per PCR, sequenziamento e saggi molecolari.
- Garantisce rese e purezza riproducibili dell'estrazione per la standardizzazione dei saggi.
- Permette la preparazione scalabile di campioni di acidi nucleici validati per flussi di lavoro di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla scoperta di biomarcatori traslazionali supportando analisi genomiche di isolati clinici.
- Mantiene la continuità dalla scoperta dell'agente patogeno fino agli studi preclinici sulla resistenza e sulla virulenza.
- Riduce il rischio biologico nel progresso di candidati mirati alle infezioni micobatteriche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo di estrazione CTAB si integra nella fase di preparazione del campione, collegando l'isolamento del patogeno ai flussi di lavoro molecolari e genomici successivi.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi sulla funzione genica e sui meccanismi di resistenza nei micobatteri.
- Screening: Fornisce DNA ad alta purezza e riproducibile per lo sviluppo e la validazione di saggi.
- Analisi: Offre parametri quantitativi di resa e purezza (ad esempio, rapporti NanoDrop, elettroforesi su gel) per la valutazione della qualità del campione.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'epidemiologia genomica e l'allineamento di biomarcatori nei flussi di lavoro per le malattie infettive.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato di estrazione adattabile tra diverse specie di micobatteri e programmi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli studi genetici e sulla resistenza assicurando l'integrità del DNA.
- Valore operativo: Fornisce un'estrazione standardizzata e riproducibile con capacità di elaborazione scalabile.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nei settori della genomica dei patogeni e della sorveglianza della resistenza.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione degli asset nella ricerca sulle malattie infettive in base alla gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella manipolazione di micobatteri patogeni ed estrazione di acidi nucleici.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per centrifugazione, incubazione e analisi spettrofotometrica.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire riproducibilità e controllo delle contaminazioni.
- Adattabile sia a specie micobatteriche a crescita rapida che lenta, con opportune ottimizzazioni del protocollo.
- La resa e la purezza possono variare in base alla specie, richiedendo un controllo di qualità ad ogni estrazione.
