Name: Bioprinting di fette tumorali in idrogel come modello 3D per il linfoma mantellare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri la biostampa di fette tumorali in idrogel per lo studio del linfoma mantellare. Questo modello 3D migliora la rilevanza fisiologica rispetto alle colture 2D e aiuta a comprendere i meccanismi di resistenza ai farmaci.

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<ol><li>Jain, P., Wang, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma+in+2022-a+comprehensive+update+on+molecular+pathogenesis%2C+risk+stratification%2C+clinical+approach%2C+and+current+and+novel+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma in 2022-a comprehensive update on molecular pathogenesis, risk stratification, clinical approach, and current and novel treatments.</a> Am J Hematol. 97 (5), 638-656 (2022).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).</li>
<li>Wen, T., Wang, J., Shi, Y., Qian, H., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+targeting+Bruton%27s+tyrosine+kinase+in+cancers%3A+Drug+development+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Inhibitors targeting Bruton's tyrosine kinase in cancers: Drug development advances.</a> Leukemia. 35 (2), 312-332 (2021).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1%2F2+study+of+zilovertamab+and+ibrutinib+in+mantle+cell+lymphoma+%28mcl%29+or+chronic+lymphocytic+leukemia+%28cll%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase 1/2 study of zilovertamab and ibrutinib in mantle cell lymphoma (mcl) or chronic lymphocytic leukemia (cll).</a> J Clin Oncol. 40 (16_suppl), 7520(2022).</li>
<li>Roué, G., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+drug+resistance+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Management of drug resistance in mantle cell lymphoma.</a> Cancers. 12 (6), 1565(2020).</li>
<li>Araujo-Ayala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+patient-derived+3d+model+recapitulates+mantle+cell+lymphoma+lymph+node+signaling%2C+immune+profile%2C+and+in+vivo+ibrutinib+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A novel patient-derived 3d model recapitulates mantle cell lymphoma lymph node signaling, immune profile, and in vivo ibrutinib responses.</a> Leukemia. 37 (6), 1311-1323 (2023).</li>
<li>Bryant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intermediate-grade+%28mantle+cell%29+and+low-grade+%28small+lymphocytic+and+marginal+zone%29+human+non-Hodgkin%27s+lymphomas+xenotransplanted+in+severe+combined+immunodeficiency+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of intermediate-grade (mantle cell) and low-grade (small lymphocytic and marginal zone) human non-Hodgkin's lymphomas xenotransplanted in severe combined immunodeficiency mouse models.</a> Lab Invest. 80 (4), 557-573 (2000).</li>
<li>Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+cell+culture+in+alginate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">3d cell culture in alginate hydrogels.</a> Microarrays. 4 (2), 133-161 (2015).</li>
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<li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).</li>
<li>Hickman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology%3A+Capturing+tumor+complexity+in+vitro%2Fex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnol J. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li>
<li>Rossi, M., Alviano, F., Righi, S., Sabattini, E., Agostinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models%3A+A+novel+approach+for+lymphoma+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models: A novel approach for lymphoma research.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 148 (4), 753-765 (2022).</li>
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<li>Chiron, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+targeted+therapies+to+overcome+microenvironment-dependent+expansion+of+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rational targeted therapies to overcome microenvironment-dependent expansion of mantle cell lymphoma.</a> Blood. 128 (24), 2808-2818 (2016).</li>
<li>Nylund, P., Nikkarinen, A., Ek, S., Glimelius, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empowering+macrophages%3A+The+cancer+fighters+within+the+tumour+microenvironment+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Empowering macrophages: The cancer fighters within the tumour microenvironment in mantle cell lymphoma.</a> Front Immunol. 15, 1373269(2024).</li>
<li>Nygren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+levels+are+prognostic+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T-cell levels are prognostic in mantle cell lymphoma.</a> Clin Cancer Res. 20 (23), 6096-6104 (2014).</li>
<li>Medina, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+protect+mantle+cell+lymphoma+cells+from+spontaneous+and+drug-induced+apoptosis+through+secretion+of+b-cell+activating+factor+and+activation+of+the+canonical+and+non-canonical+nuclear+factor+%CE%BAb+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of b-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor κb pathways.</a> Haematologica. 97 (8), 1255-1263 (2012).</li>
<li>Jindal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cers6-as1%2Ffgfr1+axis+as+synthetic+vulnerability+to+constrain+stromal+cells+supported+proliferation+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Targeting cers6-as1/fgfr1 axis as synthetic vulnerability to constrain stromal cells supported proliferation in mantle cell lymphoma.</a> Leukemia. 38 (10), 2196-2209 (2024).</li>
<li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+patient-derived+organoid+culture+platform+for+mantle+cell+lymphoma+drug+sensitivity+and+car+t+cell+anti-tumor+activity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Establishment of a patient-derived organoid culture platform for mantle cell lymphoma drug sensitivity and car t cell anti-tumor activity assay.</a> Blood. 140 (Supplement 1), 9219-9220 (2022).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).</li>
<li>Van Der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+Taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short-term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug Taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6 (1), 86(2006).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76 (1), 469-477 (1999).</li>
<li>Porter, A. G., Jänicke, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+caspase-3+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differentiat%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of caspase-3 in apoptosis.</a> Cell Death Differentiat. 6 (2), 99-104 (1999).</li>
<li>Huseynov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+mantle+cell+lymphoma+in+transplant+non-eligible+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Transfus+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Treatment of mantle cell lymphoma in transplant non-eligible patients.</a> Hematol Transfus Cell Ther. 44, S2-S3 (2022).</li>
<li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+bioprinted+cancer+models%3A+Revolutionizing+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">3d bioprinted cancer models: Revolutionizing personalized cancer therapy.</a> Transl Oncol. 14 (4), 101015(2021).</li>
<li>Budharaju, H., Sundaramurthi, D., Sethuraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedded+3d+bioprinting+%E2%80%93+an+emerging+strategy+to+fabricate+biomimetic+%26+large+vascularized+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioact+Mater%22%5BJournal%5D)">Embedded 3d bioprinting – an emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs.</a> Bioact Mater. 32, 356-384 (2024).</li>
<li>Seaman, K., Sun, Y., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cancer-on-a-chip+tissue+models+to+dissect+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Med-X%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cancer-on-a-chip tissue models to dissect the tumour microenvironment.</a> Med-X. 1 (1), 11(2023).</li>
<li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro%3A+Histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Capturing complex tumour biology in vitro: Histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Sci Rep. 5 (1), 17187(2015).</li>
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<li>Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement-membrane+components+associated+with+the+extracellular+matrix+of+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node.</a> Cell Tissue Res. 252 (2), 367-375 (1988).</li>
<li>Kaldjian, E. P., Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shi, Y., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+molecular+organization+of+lymph+node+T+cell+cortex%3A+A+labyrinthine+cavity+bounded+by+an+epithelium-like+monolayer+of+fibroblastic+reticular+cells+anchored+to+basement+membrane-like+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spatial and molecular organization of lymph node T cell cortex: A labyrinthine cavity bounded by an epithelium-like monolayer of fibroblastic reticular cells anchored to basement membrane-like extracellular matrix.</a> Int Immunol. 13 (10), 1243-1253 (2001).</li>
<li>German, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plug-and-play+lymph+node-on-chip%3A+Secondary+tumor+modeling+by+the+combination+of+cell+spheroid%2C+collagen+sponge%2C+and+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Plug-and-play lymph node-on-chip: Secondary tumor modeling by the combination of cell spheroid, collagen sponge, and T-cells.</a> Int J Mol Sci. 24 (4), 3183(2023).</li>
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<li>Ogassavara, B., Tucunduva Neto, R. R., De Souza, R. R., Tucunduva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+evaluation+of+the+morphometric+patterns+of+lymph+nodes+of+the+head+and+neck+in+young+and+middle-aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Ultrasound evaluation of the morphometric patterns of lymph nodes of the head and neck in young and middle-aged individuals.</a> Radiol Brasileira. 49 (4), 225-228 (2016).</li>
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<li>Subrahmanyam, N., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+extracellular+matrix+biology+for+tumor+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Personalized+Med%22%5BJournal%5D)">Harnessing extracellular matrix biology for tumor drug delivery.</a> J Personalized Med. 11 (2), 88(2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>&micro;-slide 8 pozzetti fondo in vetro</td><td>ibidi GmbH</td><td>80827</td><td>Vetrini con fondo in vetro utilizzati per l'imaging dal vivo di fette di idrogel</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>9150.1</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>10X RPMI-1640 medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Codice: R1145</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>Siringa a tenuta di gas da 2,5 ml modello 1002 TLL</td><td>Hamilton</td><td>81420</td><td>Siringa per bioprinting</td></tr><tr><td>Stampante 3D per estrusione, PrintrBot Simple</td><td>Printrbot</td><td></td><td>Auto-modificato per consentire la stampa di bioink</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Th. Geyer GmbH & Co.KG</td><td>7696790</td><td>Coltura delle fette di idrogel</td></tr><tr><td>Sistemi di filtrazione sottovuoto per bottiglie, membrana PES, 500 ml, 0,22 & micro; m dimensione dei pori, 70&nbsp; mm di diametro membrana</td><td>Corning Inc.</td><td>513-3355</td><td>Filtrazione sterile di tamponi</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio disidratato</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>T885.2</td><td>Componente del tampone di lavaggio e della sospensione gelatinosa</td></tr><tr><td>Collagene I da ratto</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS354249</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>Software Cura versione 15.04.5 per la stampa 3D</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>Software utilizzato per la stampa 3D</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus SA</td><td>DR50050</td><td>Colorante per l'imaging dal vivo di fette di idrogel</td></tr><tr><td>Sale disodico diidrato dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>Componente del tampone di dissoluzione dell'alginato</td></tr><tr><td>Contatore automatico di celle EVE</td><td>Nano EnTek Inc.</td><td>10027-452</td><td>Contatore di celle</td></tr><tr><td>Piastre di Petri batteriologiche Falcon con coperchio, diametro 35 mm</td><td>Falcone</td><td>351008</td><td>Riempito con impasto gelatinoso per formare il bagno di supporto per il bioprinting</td></tr><tr><td>Provette Falcon, 50 mL</td><td>Sarstedt AG & Co.KG</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0615</td><td>Integratore di terreno per colture cellulari</td></tr><tr><td>Gelatina dalla pelle suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Componente principale dell'impasto gelatinoso</td></tr><tr><td>HEPES, acido libero, grado di biologia molecolare</td><td>Merck KGaA</td><td>CAS 7365-45-9</td><td>Componente del tampone di lavaggio e della sospensione gelatinosa</td></tr><tr><td>Linea cellulare Jeko-1 MCL</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Linea cellulare MCL</td></tr><tr><td>KIMTECH Science Salviette di precisione</td><td>Società Kimberly Clark</td><td>7551</td><td>Utilizzato per aspirare l'acqua in eccesso dall'impasto di gelatina e per rimuovere le goccioline dall'ugello della stampante 3D</td></tr><tr><td>Software LAS X versione 3.5.7.23225</td><td>Leica</td><td></td><td>Software utilizzato per le ricostruzioni 3D</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 Microscopio a scansione laser confocale</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td>Microscopio confocale per l'imaging dal vivo</td></tr><tr><td>Barattolo di vetro Pinta regolare 16 oz</td><td>Società Ball</td><td>G001</td><td>Barattolo in cui viene preparato l'impasto di gelatina</td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR) Matrigel</td><td>Corning Inc.</td><td>356231</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>Inserto per colture cellulari Millicell, 0,4 &micro; m Dimensione dei pori</td><td>Merck KGaA</td><td>PICMORG 50</td><td>Supporto filtro per fette di idrogel</td></tr><tr><td>Substrato NucView 405 Caspasi-3, 1 mM in 1x PBS</td><td>Biozio</td><td>10405</td><td>Colorante per l'imaging dal vivo di fette di idrogel</td></tr><tr><td>Frullatore Oster Professional Series</td><td>Oster</td><td>BPST02-B00</td><td>Frullatore per generare impasto di gelatina</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptamicina</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td>Integratore per terreno di coltura cellulare MCL</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-Reagenzien</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Colorante per l'imaging dal vivo di fette di idrogel</td></tr><tr><td>Rotina 35 R</td><td>Hettich</td><td>24573</td><td>Centrifugazione delle cellule</td></tr><tr><td>Centrifuga ROTINA 38/38R</td><td>Hettich</td><td>Z720109</td><td>Centrifugazione di fanghi di gelatina</td></tr><tr><td>RPMI-1640+GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870036</td><td>Base del terreno di coltura per cellule MCL</td></tr><tr><td>Alginato di sodio</td><td>Cooperazione FMC</td><td>GQ9109901</td><td>Componente Bioink</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06404</td><td>Componente del tampone di dissoluzione dell'alginato</td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>3580.1</td><td>Componente del tampone di dissoluzione dell'alginato</td></tr><tr><td>Cannule Sterican per applicazione smussata 21G 0,8x22 mm</td><td>B.Braun</td><td>9180109</td><td>Ugello per la stampa 3D</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina-metilestere-perclorato (TMRM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5428</td><td>Colorante per l'imaging dal vivo di fette di idrogel</td></tr><tr><td>Blu di tripano, 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Colorazione per analisi di vitalità</td></tr><tr><td>Termometro a tenuta stagna</td><td>VWR</td><td>620-2099</td><td>Termometro per monitorare la temperatura dell'impasto di gelatina</td></tr></tbody></table>

bioprinting di fette tumorali in idrogel come modello 3d per il linfoma mantellare

Bioprinting of Hydrogel Tumor Slices as a 3D Model for Mantle Cell Lymphoma

Le fette tumorali di idrogel contenenti cellule MCL sono state generate con il protocollo sopra descritto. Le fasi del flusso di lavoro per la stampa 3D e la coltura delle fette tumorali di idrogel sono mostrate nella Figura 1A. La stampante 3D utilizzata è stata modificata per la stampa FRESH con l'aggiunta di un estensore della pompa a siringa, come descritto in Hinton et al.20 (Figura 1B). Sono state stampate fino a cinque fette contemporaneamente (Figura 1C) e coltivate su un supporto filtrante (Figura 1D). Il terreno è stato aggiunto sotto il supporto del filtro per fornire un apporto di nutrienti alle fette tumorali di idrogel. Una goccia di terreno è stata aggiunta sopra ogni fetta tumorale di idrogel per evitare che si secchiassero. Una panoramica di cinque fette tumorali di idrogel coltivate su un supporto filtrante è mostrata nella Figura 1E, insieme a immagini ravvicinate di una fetta di idrogel. Durante un periodo di coltura di 3 giorni, le fette tumorali di idrogel sono rimaste stabili e hanno mantenuto la loro struttura (Figura 2A). Subito dopo la stampa, le bolle d'aria erano presenti nelle fette tumorali di idrogel, ma sono scomparse durante la coltivazione (Figura 2A).
La vitalità della linea cellulare MCL Jeko-1 coltivata in fette tumorali di idrogel (3D) rispetto alle cellule Jeko-1 coltivate in coltura in sospensione (2D) è stata valutata mediante saggio di esclusione del blu di tripano (Figura 2B). Dopo 3 giorni di coltura, l'80% delle cellule era vitale, rispetto a una vitalità iniziale dell'88% delle cellule Jeko-1 prima della stampa. Le cellule Jeko-1 coltivate in 2D hanno mantenuto la vitalità iniziale dell'88%. Non c'era alcuna differenza significativa tra le cellule Jeko-1 coltivate in 2D e 3D. Per valutare se le cellule di Jeko-1 proliferano nelle fette di idrogel, è stato determinato il numero medio di cellule di Jeko-1 per fetta di idrogel (Figura 2C). Mentre 5x105 cellule Jeko-1 erano contenute in ogni fetta subito dopo la stampa (d0), questo numero è quasi raddoppiato a 9,3x105 cellule dopo 3 giorni di coltura.
La distribuzione e lo stato delle cellule Jeko-1 coltivate in fette di idrogel sono stati valutati mediante imaging a fluorescenza live a quattro colori (Figura 2D) direttamente dopo la stampa o dopo 3 giorni di coltura. Dopo la stampa, le ricostruzioni 3D delle fette di idrogel Jeko-1 hanno mostrato una distribuzione omogenea delle cellule. La maggior parte delle cellule era positiva per TMRM, un marcatore per il potenziale di membrana mitocondriale22. Una minoranza di cellule era positiva per l'attività della caspasi-3, un marcatore per l'induzione dell'apoptosi23, così come per il marcatore di cellule morte PicoGreen21. Dopo 3 giorni di coltura, è stato osservato un aumento del numero di cellule insieme alla formazione di cluster cellulari. La maggior parte delle cellule è rimasta positiva al TMRM, mentre solo poche cellule sono risultate positive per l'attività della caspasi-3 o del PicoGreen (Figura 2C).
Per analizzare se le cellule MCL in fette di idrogel rispondono ai chemioterapici, le cellule Jeko-1 coltivate in coltura in sospensione (2D) o in fette di idrogel (3D) sono state trattate con il farmaco chemioterapico Doxorubicina, che fa parte del trattamento standard per i pazienti con MCL24. La struttura complessiva delle fette di idrogel è stata mantenuta durante il trattamento con doxorubicina (Figura 3A). La vitalità delle cellule Jeko-1 coltivate in fette di idrogel è diminuita in modo dose-dipendente in risposta al trattamento con doxorubicina. L'IC50 della doxorubicina nelle cellule Jeko-1 è aumentato quando le cellule sono state coltivate in fette di idrogel (IC50=5,8 μM) rispetto alle cellule Jeko-1 coltivate in coltura in sospensione 2D (IC50=2,0μM; Figura 3B). L'imaging a fluorescenza dal vivo a quattro colori ha mostrato una riduzione del TMRM e un aumento del segnale PicoGreen nelle cellule Jeko-1 coltivate in fette di idrogel in risposta al trattamento con doxorubicina, confermando una riduzione della vitalità indotta dal trattamento. Le immagini ottenute dall'imaging a fluorescenza dal vivo a quattro colori sono state ricostruite in 3D, segmentate in base al segnale dei nuclei DRAQ5 e analizzate utilizzando lo script Python descritto nel file supplementare 1. Una maschera di segmentazione esemplare è mostrata nella Figura 1 supplementare. Il numero di cellule identificato dal segnale DRAQ5 è stato utilizzato per determinare il numero totale di cellule. Il numero di cellule positive per l'attività di TMRM, PicoGreen e Caspasi-3 è stato utilizzato per identificare la percentuale di cellule vitali, morte o apoptotiche, rispettivamente. Le quantificazioni della colorazione a fluorescenza viva a quattro colori di cellule Jeko-1 coltivate in fette di idrogel per 3 giorni con o senza 9 μM di doxorubicina hanno mostrato una vitalità paragonabile al saggio di esclusione del blu di tripano (Tabella 2).
Oltre alle linee cellulari MCL consolidate, le cellule MCL primarie di tre diversi pazienti con MCL sono state coltivate in coltura in sospensione 2D o in fette di idrogel 3D (Figura 4, Figura 2 supplementare). Come verificato da un patologo, tutti e tre gli MCL (pazienti 1-3) erano di morfologia classica/comune con indici Ki67 del 20%-50%. Le cellule MCL primarie includevano tutti i tipi di cellule isolate dai linfonodi dei pazienti con MCL e quindi contenevano non solo cellule MCL ma anche altri tipi di cellule immunitarie o cellule stromali. La vitalità delle fette primarie di idrogel MCL è stata valutata mediante il test di esclusione del blu di tripano. Dopo 4 giorni di coltura, le cellule MCL primarie in fette di idrogel hanno mantenuto una vitalità del 43,6% (45,7% il giorno 3) rispetto a una vitalità basale del 71,0% prima della stampa (Figura 4A). Ciò rappresenta una maggiore vitalità rispetto alle cellule coltivate in sospensione (2D), che avevano una sopravvivenza del 19,6% dopo quattro giorni di coltura (28,4% il giorno 3). Questa vitalità è stata visualizzata mediante imaging a fluorescenza dal vivo a quattro colori, in cui la maggior parte delle cellule erano TMRM-positive e vitali, mentre una sottopopolazione era positiva per l'attività della Caspasi-3 e di PicoGreen, indicando rispettivamente apoptosi e morte cellulare (Figura 4B). I dati di quantificazione della Figura 4B sono mostrati nella Tabella 2. Le cellule primarie di altri due pazienti con MCL hanno mostrato una maggiore sopravvivenza delle cellule quando coltivate nelle fette di idrogel (3D) rispetto alla rispettiva coltura in sospensione 2D (Figura 1 supplementare).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig1.jpg"> 
Figura 1: Flusso di lavoro della stampa 3D di fette tumorali di idrogel . (A) Flusso di lavoro della stampa 3D e della coltura di cellule in fette tumorali di idrogel. (B) Configurazione della stampante utilizzata per la biostampa 3D di fette di idrogel in un bagno di supporto in gelatina. (C) Stampa di un progetto nel software della stampante 3D. Sono state stampate fino a cinque fette di idrogel contemporaneamente. (D) Rappresentazione schematica della coltura di fette di idrogel. Le fette di idrogel sono state coltivate su un supporto filtrante in una piastra a 6 pozzetti. Una goccia di terreno è stata aggiunta sopra ogni fetta di idrogel per mantenerne l'umidità. È possibile coltivare fino a cinque fette di idrogel su un supporto filtrante. (E) Fette di idrogel stampate in 3D coltivate su un supporto filtrante, come mostrato da un'immagine panoramica o da immagini ravvicinate. Le barre della scala rappresentano 5 mm, 1 mm o 200 μm come indicato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig2.jpg"> 
Figura 2: Coltura di una linea cellulare di linfoma mantellare (MCL) in fette di idrogel stampate in 3D. (A) Primo piano di una fetta di idrogel rappresentativa contenente la linea cellulare MCL Jeko-1 dopo la stampa (d0) o dopo 3 giorni di coltura (d3). La barra della scala rappresenta 1 mm. (B) Vitalità delle cellule Jeko-1 coltivate in sospensione (2D) o in fette di idrogel (3D) per 2 giorni, come valutato mediante saggio di esclusione del blu di tripano. Viene mostrata la media ± SD di tre esperimenti di bioprinting indipendenti. (C) Numero di cellule Jeko-1 contenuto in ogni fetta di idrogel subito dopo la stampa (d0) o dopo un massimo di 3 giorni di coltura (d1-d3). Viene mostrata la media ± SD di tre esperimenti di bioprinting indipendenti. Non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa (n.s., p &gt; 0.05, test di Mann-Whitney). (D) Ricostruzione tridimensionale di fette di idrogel Jeko-1 il giorno della stampa (d0) o dopo 3 giorni di coltura (d3). Il modello è stato generato da z-stack di un'imaging a fluorescenza 3D in tempo reale a quattro colori. Le cellule viventi sono mostrate in rosso (TMRM), le cellule apoptotiche in giallo (attività enzimatica della caspasi-3), le cellule morte in verde (PicoGreen) e i nuclei in blu (DRAQ5). La barra della scala rappresenta 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig3.jpg"> 
Figura 3: Trattamento farmacologico di una linea cellulare di linfoma mantellare (MCL) in fette di idrogel. (A) Primo piano di una fetta di idrogel rappresentativa contenente la linea cellulare MCL Jeko-1 trattata con 3 μM di Doxorubicina per 3 giorni (d3). La barra della scala rappresenta 1 mm. (B) Le cellule Jeko-1 coltivate in sospensione (2D) o in fette di idrogel (3D) sono state trattate con concentrazioni crescenti dell'agente chemioterapico Doxorubicina per 2 giorni. La vitalità delle cellule è stata valutata mediante il saggio di esclusione del blu di tripano. Viene mostrata la SD media ± di quattro esperimenti di bioprinting indipendenti. (C) Ricostruzione tridimensionale di fette di idrogel Jeko-1 trattate con 9 μM di Doxorubicina (Doxo) per 3 giorni (d3). Il modello è stato generato da z-stack di un'imaging a fluorescenza 3D in tempo reale a quattro colori. Le cellule viventi sono mostrate in rosso (TMRM), le cellule apoptotiche in giallo (attività enzimatica della caspasi-3), le cellule morte in verde (PicoGreen) e i nuclei in blu (DRAQ5). La barra della scala rappresenta 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig4.jpg"> 
Figura 4: Coltura di cellule MCL primarie in fette di idrogel stampate in 3D. (A) Vitalità di cellule MCL primarie coltivate in sospensione (2D) o in fette di idrogel (3D) per un massimo di 4 giorni, come valutato mediante saggio di esclusione del blu di tripano. Viene mostrata la fattibilità media di un esperimento. (B) Ricostruzione tridimensionale di cellule MCL primarie coltivate in fette di idrogel (3D) per 3 giorni. Gli Z-stack sono stati generati da fette di idrogel colorate con una colorazione live a quattro colori e analizzate utilizzando un microscopio a scansione laser confocale (CLSM). Le cellule viventi sono mostrate in rosso (TMRM), le cellule apoptotiche in giallo (attività enzimatica della caspasi-3), le cellule morte in verde (PicoGreen) e i nuclei in blu (DRAQ5). La barra della scala rappresenta 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Macchia</td>
			<td>TMRM</td>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Substrato NucView405 Caspasi-3</td>
			<td>PicoGreen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eccitazione/Emissione</td>
			<td>548 nm/574 nm</td>
			<td>647 nm/681 nm</td>
			<td>429 nm/ 469 nm</td>
			<td>488 nm/ 520 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Massimi di eccitazione/emissione dei coloranti utilizzati per l'imaging a fluorescenza 3D in quadricromia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Campione</td>
			<td colspan="3">% di celle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (Cellule vitali)</td>
			<td>PicoGreen (Cellule morte)</td>
			<td>Caspasi-3 (Cellule apoptotiche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeko-1 Ctrl</td>
			<td>83</td>
			<td>23.6</td>
			<td>18.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeko-1 Doxo 9 μM</td>
			<td>27.6</td>
			<td>81.3</td>
			<td>86.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paziente MCL primario 1</td>
			<td>75.2</td>
			<td>31.1</td>
			<td>33.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Quantificazione di ricostruzioni 3D di colorazione dal vivo in quadricromia di fette tumorali di idrogel coltivate. Le fette tumorali di idrogel sono state coltivate per 3 giorni e contenevano cellule Jeko-1 coltivate con o senza trattamento con 9 μM di doxorubicina o cellule MCL primarie (paziente 1).
Figura 1 supplementare: Identificazione cellulare da ricostruzioni 3D di colorazione live in quadricromia. Ricostruzioni 3D di immagini confocali marcate con DRAQ5 ottenute da (A) colorazione live a quattro colori e (B) un'immagine segmentata su questo canale generata utilizzando la pipeline di analisi delle immagini Python. La barra della scala rappresenta 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/JoVE_Suppl_Figure%201.tiff" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa figura.</a>
Figure 2 supplementare: Coltura di cellule MCL primarie dei pazienti 2 e 3 in fette tumorali di idrogel . Vitalità delle cellule MCL primarie del paziente (A) 2 o (B) del paziente 3 coltivate in sospensione (2D) o in fette di idrogel (3D) per un massimo di 4 giorni, come valutato mediante saggio di esclusione del blu di tripano. Viene mostrata la fattibilità media di un esperimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/JoVE_Suppl_Figure%202.tiff" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa figura.</a>
File supplementare 1: Istruzioni per l'analisi delle ricostruzioni 3D ottenute dalla colorazione in quadricromia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Supplementary_File_1_proof%20read%20version.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Script Python per l'analisi di ricostruzioni 3D ottenute dalla colorazione in quadricromia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Supplementary_File_2.ipynb%20" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Supplementary Coding File 1: file Stl. contenente il progetto per le fette tumorali di idrogel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Hydrogel%20slice%208mm%201.5mm.stl" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Bioprinting di fette tumorali in idrogel come modello 3D per il linfoma mantellare

Mantle cell lymphoma (MCL) is a rare, aggressive B-cell neoplasm that frequently relapses and only shows a limited response to conventional chemotherapy. ...

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