Misurazione della guanosina monofosfato ciclico (cGMP) nei tessuti solidi mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico competitivo (ELISA)

Il laboratorio Dechter studia il metabolismo dell'ossido nitrico. L'ossido nitrico stimola la formazione ciclica di GMP attraverso una cascata di omeostasi adattiva. Il nostro obiettivo è capire come l'invecchiamento, la dieta e altri fattori influenzano questa cascata. Ricerche precedenti si sono concentrate sulla formazione dell'ossido nitrico e sui conseguenti effetti fisiologici trascurando la cascata che collega i due. Il nostro protocollo misura il GMP ciclico, un secondo messaggero nella cascata. Il nostro protocollo è semplice, accessibile e facilmente adattabile a vari tipi di tessuto.

[Narratore] Iniziare

Metti un polverizzatore, una pinzetta e un cucchiaio sul ghiaccio secco per 10 minuti. Pesare un eccesso di tessuto suino per tenere conto della perdita durante la polverizzazione. Trasferire il fazzoletto nel polverizzatore refrigerato posto su ghiaccio secco. Congelare il tessuto versando azoto liquido nel polverizzatore e lasciarlo vaporizzare completamente prima di procedere. Quindi riposizionare il coperchio del polverizzatore e colpirlo 15 volte con un martello. Ora, tarare un tubo omogeneizzatore di perline su una bilancia. Usando il cucchiaio e le pinzette raffreddati, trasferisci il tessuto polverizzato nel tubo. Pipettare 0,1 di acido cloridrico normale nella provetta di omogeneizzazione, assicurandosi che il volume in microlitri sia un multiplo della massa tissutale in milligrammi. Quindi omogeneizzare il campione di tessuto utilizzando un omogeneizzatore a microsfere. Centrifugare l'omogeneizzato a 17.000 g per 30 minuti, mantenendo una temperatura del campione di quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante risultante in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare nuovamente per 10 minuti, mantenendo una temperatura del campione di quattro gradi Celsius. Pipettare un'aliquota del surnatante finale in una provetta da microcentrifuga e metterla sul ghiaccio. Quindi, pipettare 9,9 millilitri di tampone ELISA in una provetta etichettata Standard B. Pipettare 100 microlitri di soluzione madre standard nella provetta standard B. Agitare accuratamente per garantire una sospensione uniforme. Trasferire 1.000 microlitri di soluzione dallo Standard B alla provetta etichettata Standard 1. Quindi aggiungere 500 microlitri di tampone ELISA alle provette etichettate Standard 0 e Standard da 2 a 8. Standard Vortice 1. Quindi trasferire 500 microlitri di soluzione nello Standard 2. Quindi vorticare Standard 2 e trasferire 500 microlitri di soluzione nello standard 3. Continuate a trasferire 500 microlitri da ogni standard precedente a quello successivo, vorticando accuratamente dopo ogni edizione fino a quando non viene preparato lo Standard 8. Per l'acetilazione dei campioni, aggiungere 50 microlitri di idrossido di potassio a quattro molari a un'aliquota di campione da 250 microlitri. Aggiungere immediatamente 12,5 microlitri di anidride acetica. Agitare la soluzione per 15 secondi. Quindi pipettare 12,5 microlitri di idrossido di potassio a quattro molari e vorticare di nuovo. Alla provetta etichettata Standard 0, aggiungere 100 microlitri di idrossido di potassio a quattro molari, seguiti immediatamente da 25 microlitri di anidride acetica. Dopo l'agitazione, pipettare 25 microlitri di idrossido di potassio a quattro molari nella provetta e agitare brevemente. Ripetere le aggiunte di idrossido di potassio e anidride acetica, seguite dal vortice per gli standard rimanenti, aggiungere un rapporto predeterminato di tampone ELISA e aliquota del campione acetilato in una provetta da microcentrifuga. Standard Vortice 0. Trasferire aliquote da 50 microlitri di pozzetti Standard 0 a cinque pozzetti designati come pozzetti NSB e B della micropiastra ELISA. Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone ELISA nei due pozzetti NSB contenenti lo Standard 0. Utilizzando un singolo puntale per pipetta, aggiungere aliquote da 50 microlitri di Standard da 1 a 8 in pozzetti duplicati, iniziando con lo Standard 8 e procedendo con lo Standard 1. Vortice ogni campione. Quindi aggiungere 50 microlitri negli appositi pozzetti in doppio o triplice copiato. Ora, pipettare 50 microlitri di tracciante acetilcolinesterasi in tutti i pozzetti designati come NSB, B naught, standard e campione. Aggiungere 50 microlitri di antisiero a ciascun elemento B, standard e campionare bene. Coprire la piastra ELISA e incubare a quattro gradi Celsius per 18 ore. Dopo l'incubazione, capovolgere la piastra ELISA su un contenitore per rifiuti per smaltire il contenuto. Riempire i pozzetti con il tampone di lavaggio utilizzando un flacone di lavaggio. Agitare delicatamente per cinque secondi. Quindi scaricare il tampone di lavaggio e picchiettare il liquido rimanente su un tovagliolo di carta. Ora, trasferisci il reagente di Ellman in un serbatoio. Lavorando rapidamente, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri di reagente di Ellman ai pozzetti del bianco, NSB, B naught, TA, standard e campione. Aggiungere cinque microlitri di tracciante acetilcolinesterasi al pozzetto TA. Quindi coprire la piastra ELISA con Parafilm. Metterlo in un contenitore protetto dalla luce per incubare a temperatura ambiente agitando per 60-90 minuti. Rimuovere il Parafilm e leggere la densità ottica a 412 nanometri La concentrazione di GMP ciclico nel fegato suino nel gruppo di controllo era di circa 0,0202 nanomoli per grammo di tessuto. Nel gruppo trattato con nitrati, la concentrazione ciclica di GMP è aumentata a circa 0,0364 nanomoli per grammo di tessuto.