Raccolta di liquidi per il lavaggio nasale muino senza contaminazione del sangue

Il presente protocollo descrive un nuovo metodo per evitare la contaminazione del sangue nel liquido di lavaggio nasale murino (NLF). Poiché questo metodo garantisce la raccolta dell'NLF senza contaminazione del sangue, consente rilevamenti più accurati dei componenti immunologici e di vari agenti patogeni respiratori.

La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di un metodo per raccogliere il liquido di lavaggio nasale dai topi in grandi volumi, affrontando due sfide principali: ottenere un'elevata resa e prevenire la contaminazione del sangue.

Esistono due approcci per raccogliere il liquido di lavaggio nasale: la via faringea, che produce volumi maggiori, e la via tracheale, che riduce la contaminazione del sangue.

Il nostro metodo consente la raccolta di grandi volumi di liquido di lavaggio nasale dalla faringe, mentre il posizionamento di batuffoli di cotone nella bocca del roditore aiuta a ridurre al minimo la contaminazione del sangue. L'approccio è semplice ed economico.

Per rilevare la contaminazione del sangue nel campione, impieghiamo il metodo forense, noto come reazione al luminol. La reazione del luminol è semplice e più sensibile di altri metodi.

La concentrazione di IgG nel sangue è molto più alta di quella nel liquido di lavaggio nasale. Il nostro metodo, che evita la contaminazione del sangue, è fondamentale nella ricerca immunologica. È adatto anche per l'analisi di altre molecole, come il microbioma, dove la contaminazione del sangue può compromettere l'accuratezza.

[Narratore] Per iniziare, posiziona il topo soppresso sulla schiena su una placca chirurgica e fissa tutti e quattro gli arti usando degli spilli. Usando una siringa da un millilitro, raccogliere il sangue dal cuore. Usando le forbici, apri la cavità addominale per esporre gli organi viscerali e il diaframma. Incidere il diaframma e le nervature per rivelare l'atrio destro. Quindi, perforare l'atrio destro con le forbici per drenare il sangue rimanente. Metti tre batuffoli di cotone nella bocca dell'animale mentre tiri la lingua in avanti. Quindi, sollevare la testa in posizione con il naso all'insù e utilizzare le forbici per separare la mascella inferiore per evitare la contaminazione del sangue nel liquido di lavaggio nasale. Sostituisci i batuffoli di cotone con quelli freschi per evitare la contaminazione del sangue. Dopo che l'emorragia si è fermata, iniettare 200 microlitri di PBS sterile nella coana e raccogliere il liquido di lavaggio nasale espulso dalle narici in una provetta da 1,5 millilitri. Per preparare la soluzione madre per la rilevazione della chemiluminescenza, sciogliere un milligrammo di luminol e cinque milligrammi di perossido di sodio in un millilitro di acqua sterile all'interno di una provetta da 1,5 millilitri. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e conservarlo a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Quindi, preparare una soluzione di lavoro diluendo dieci volte la soluzione madre con acqua deionizzata. Pipettare due microlitri del campione di liquido di lavaggio nasale nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di luminol diluita a ciascun pozzetto e agitare brevemente la piastra a 96 pozzetti per mescolare il contenuto. Osservare direttamente la reazione di chemiluminescenza al buio. Questa figura presenta un confronto delle concentrazioni di immunoglobulina A tra diversi tipi di campioni. Nel liquido di lavaggio nasale, la concentrazione di immunoglobulina A è inferiore nei campioni raccolti con il nuovo metodo rispetto al metodo convenzionale, mentre i campioni di siero e di liquido di lavaggio broncoalveolare non mostrano differenze sostanziali tra i due metodi. Questi dati suggeriscono che il nuovo metodo riduce la contaminazione nei campioni nasali, portando a misurazioni più accurate delle immunoglobuline A. Un modello simile si osserva per l'immunoglobulina G, con concentrazioni significativamente più basse nel liquido di lavaggio nasale raccolto con il nuovo metodo rispetto al metodo convenzionale. Al contrario, i campioni di siero e di liquido di lavaggio broncoalveolare non mostrano differenze significative tra i due metodi, suggerendo che il nuovo approccio riduce costantemente la contaminazione nei campioni nasali e migliora l'affidabilità delle misurazioni delle immunoglobuline G.