Sviluppo di un innovativo dispositivo di illuminazione basato su LED per l'applicazione in vitro della terapia fotodinamica con il Rose Bengal

Lo scopo della nostra ricerca è quello di sviluppare progetti fondamentali e traslazionali volti a caratterizzare l'effetto della terapia fotodinamica nel trattamento del cancro senza opzioni terapeutiche efficaci. Le attuali sfide sperimentali consistono nello sviluppare le tecnologie necessarie per l'implementazione della terapia fotodinamica dall'applicazione in vitro all'applicazione clinica, compresi i nuovi fotosensibilizzatori e i nuovi dispositivi di illuminazione. Rispetto ad altre tecniche, il nostro protocollo prevede un dispositivo a basso costo e fatto in casa, che consente un'illuminazione più generosa di una piastra a 96 pozzetti e delle condizioni fisiologiche all'interno di un incubatore per colture cellulari.

Per iniziare, rimuovere le cellule HepG2 in coltura dall'incubatore e posizionare il pallone sotto la stazione di sicurezza microbiologica pre-pulita. Utilizzando una pipetta, rimuovere il terreno di coltura dal matraccio di coltura. Per eliminare il mezzo residuo, sciacquare con una soluzione tamponata con fosfato mescolando delicatamente, quindi rimuovere con cura il tampone.

Quindi, applicare tre millilitri di soluzione di tripsina contenente lo 0,25% di tripsina e 0,53 millimolare di EDTA sulle cellule e riposizionare la coltura nell'incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti per staccare le cellule. Dopo cinque minuti, aggiungere sette millilitri di terreno di coltura al pallone per neutralizzare la tripsina e sospendere le cellule. Ora, trasferisci la tripsina, il terreno e le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Per contare le cellule, pipettare 20 microlitri di soluzione cellulare in una provetta pulita e aggiungere 20 microlitri di soluzione di blu di tripano. Dopo la miscelazione, caricare la miscela macchiata sul vetrino di conteggio e inserirla nel contacelle. Quindi, aggiungere il terreno di coltura a una provetta, quindi introdurre le cellule per raggiungere una concentrazione finale di 150.000 cellule per millilitro.

Seminare 1,5 volte 10 alla potenza di quattro celle per pozzetto in una piastra bianca a 96 pozzetti con un fondo chiaro e piatto. Preparare due piastre per ogni tempo di lettura di vitalità. Incubare le piastre per 24 ore prima del trattamento per consentire alle cellule di attaccarsi.

Per preparare una soluzione madre di rosa bengala, scioglierla in una soluzione salina al 10%. Diluire le soluzioni di trattamento della rosa bengala a concentrazioni comprese tra zero e 100 micromolari in terreno di coltura cellulare. Ora, rimuovere il terreno di coltura dalle piastre cellulari e aggiungere 100 microlitri delle soluzioni preparate per il trattamento del rosa bengala a ciascun pozzetto.

Incubare le cellule con rosa bengala per due ore per consentire l'internalizzazione. Dopo due ore, rimuovere la soluzione di rosa bengala da ciascun pozzetto, lavare le cellule due volte con PBS, aspirare il PBS e aggiungere 100 microlitri per pozzetto di terreno di coltura libero di rosa bengala. Coprire le micropiastre con un foglio di alluminio per proteggerle dalla luce e mettere da parte metà delle piastre per l'illuminazione durante il test di terapia fotodinamica.

Collegare il connettore maschio del distributore di luce al connettore femmina della sorgente luminosa. Rimuovere la terapia fotodinamica e le micropiastre per condizioni di buio dall'incubatrice. Scartare la piastra terapeutica fotodinamica.

Quindi, impostare il dimmer sul driver LED al livello massimo per fornire un'irradianza media di 0,62 milliwatt per centimetro quadrato attraverso i 96 pozzetti. Successivamente, posizionare la piastra sul distributore di luce. Illuminare la micropiastra fino a raggiungere la dose di luce desiderata sulle cellule.

Una volta raggiunta la dose di luce desiderata, spegnere il dispositivo. Riavvolgere la micropiastra per terapia fotodinamica in un foglio di alluminio e rimetterla insieme alla piastra di controllo nell'incubatrice fino all'esecuzione del test di vitalità. Dopo aver completato il test di terapia fotodinamica, posizionare la piastra illuminata nell'incubatore per 24 ore per consentire la risposta cellulare post-trattamento.

Dopo il periodo di incubazione, recuperare una piastra illuminata e una non illuminata. Aggiungere 100 microlitri di reagente dal kit del saggio di vitalità cellulare in ciascun pozzetto per misurare il metabolismo mitocondriale e la produzione di ATP. Incubare le piastre al buio per 10 minuti prima di procedere con la misurazione della luminescenza.

Dopo 10 minuti, leggere la luminescenza in ogni pozzetto utilizzando un lettore multimodale. Si consideri la luminescenza dei pozzetti di controllo non trattati come rappresentativa del 100% di vitalità. Normalizzare i valori di luminescenza dai pozzetti trattati a questo controllo per calcolare la percentuale di vitalità per ciascuna condizione di trattamento.

Ripetere lo stesso protocollo per la misurazione della vitalità cellulare in ulteriori punti temporali post-trattamento, ad esempio 24 ore, 48 ore e 72 ore. La sola illuminazione senza rosa bengala non ha alterato la vitalità delle cellule HepG2 a nessuna delle dosi di luce testate, e la rosa bengala da sola senza luce non ha causato cambiamenti significativi in tutte le concentrazioni. La terapia fotodinamica mediata dal bengala rosa con CELL-LED-550/3 ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule HepG2 a tutte le dosi di luce, mostrando un forte effetto citotossico.

La sovrapposizione tra il profilo di emissione del LED e lo spettro di assorbimento del rosa bengala ha confermato la compatibilità spettrale del dispositivo CELL-LED-550/3 con il fotosensibilizzatore. In futuro, uno dei nostri obiettivi principali è quello di sviluppare nuovi pacchetti PDT, ciascuno comprendente sia un composto fotosensibile che consente il targeting di specifiche cellule tumorali, sia un dispositivo di illuminazione associato.