Modellazione dell'infezione persistente da Pseudomonas aeruginosa nelle larve di zebrafish ferite

Le infezioni croniche causate dal batterio Pseudomonas aeruginosa sono tolleranti agli antibiotici e molto difficili da trattare. Il nostro obiettivo è quello di sviluppare un modello in vivo che acceleri la scoperta di terapie efficaci. I farmaci antibatterici sono per lo più sottoposti a screening in vitro e testare i farmaci nei topi con infezione cronica è una sfida complessa. Per colmare il divario tra questi due approcci, proponiamo un modello preclinico alternativo utilizzando larve di zebrafish ferite. Il nostro modello di infezione persistente nel pesce zebra basato sull'uso del ceppo clinico di Pseudomonas aeruginosa riproduce la tolleranza agli antibiotici. Mentre la microiniezione è comunemente usata per infettare le larve di zebrafish, il nostro metodo di ferita riflette una modalità di infezione naturale ed è adatto per lo screening di composti terapeutici.

[Narratore] Per iniziare, posiziona gli aghi calibro 25 sopra due bacchette per facilitare la manipolazione. Utilizzando uno stereomicroscopio, identificare e rimuovere gli embrioni che mostrano uno sviluppo anormale o non sono vitali. Muovi il piatto con un movimento circolare per raccogliere gli embrioni rimanenti al centro. Ora, usa due aghi orientati verticalmente per isolare ogni embrione, posizionando l'ago sinistro sulla coda per mantenere il corpo dritto. Con l'ago destro, fai un singolo taglio sul bordo della notocorda per rimuovere la pinna. Completa rapidamente ogni taglio, assicurandoti che tutti gli embrioni siano immersi in una soluzione batterica entro 10 minuti. Per la procedura di infezione, agitare la soluzione di Pseudomonas aeruginosa sotto una cappa di sicurezza biologica di tipo due e aggiungerla a circa una volta 10 alla potenza di sette unità formanti colonie per millilitro in una piastra a sei pozzetti. Usa una pipetta di vetro Pasteur usa e getta per raccogliere gli embrioni feriti e trasferirli nella soluzione batterica. Incubare la piastra a sei pozzetti a 28 gradi Celsius per 1,5 ore. Dopo l'incubazione, recuperare gli embrioni infetti e metterli sotto la sicurezza microbiologica per il lavaggio. Ora, trasferisci gli embrioni con una pipetta di vetro in 10 millilitri di acqua di pesce senza blu di metilene, riducendo al minimo il volume trasferito e incuba per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire nuovamente gli embrioni con una pipetta di vetro in quattro millilitri di acqua di pesce senza blu di metilene e incubare brevemente. Successivamente, con una pipetta, trasferire gli embrioni infetti singolarmente in una piastra a 24 pozzetti, aggiungendo un millilitro di acqua di pesce senza blu di metilene a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore impostato a 28 gradi Celsius. Preparare provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri con 95 microlitri di 1X PBS per ogni larva infetta. Trasferire le larve in una piastra a sei pozzetti contenente quattro millilitri di acqua di pesce senza blu di metilene per lavare e rimuovere i batteri planctonici. Metti ogni embrione lavato in una provetta da microcentrifuga con PBS, trasferendo il minor liquido possibile. Ora, usa un pestello per schiacciare ogni embrione contro il lato della provetta della microcentrifuga, lasciando poi il pestello all'interno della provetta. Quindi, sollevare il pestello e aggiungere 100 microlitri di PBS Triton al 2% per sciacquare i batteri residui dal pestello, raggiungendo una concentrazione finale dell'1%. Agitare la provetta e incubare per 10 minuti. Successivamente, erogare tre gocce da 10 microlitri di lisato non diluito da ciascun embrione su piastre di agar LB. Utilizzare una pipetta multicanale per diluire in serie ciascun lisato in una piastra a 96 pozzetti fino a 10 alla potenza di una diluizione meno tre. Infine, erogare tre gocce da 10 microlitri delle diluizioni accanto alle macchie non diluite. E incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Tutti e quattro gli isolati di Pseudomonas aeruginosa per la fibrosi cistica erano significativamente meno virulenti nel modello embrionale danneggiato rispetto al ceppo di riferimento PAO1. Negli embrioni infettati con due isolati, la carica batterica è stata notevolmente ridotta nell'arco di tre giorni, indicando l'eliminazione batterica. Al contrario, gli altri due isolati, B6513 e RP73, hanno mantenuto una carica batterica relativamente stabile da 18 a 65 ore dopo l'infezione dopo un calo iniziale, suggerendo persistenza. Un breve trattamento di 30 minuti con tobramicina a 1,5 ore dopo l'infezione ha ridotto drasticamente la carica batterica negli embrioni infettati con isolati B6513. La tobramicina non ha avuto alcun effetto significativo sulla carica batterica quando somministrata a 24 o 48 ore dopo l'infezione, dimostrando resistenza durante le fasi di infezione persistente.