Name: Ookluc: una linea di Plasmodium berghei per lidentificazione di composti che bloccano la trasmissione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Scopri un metodo di screening ad alto rendimento per identificare composti che bloccano la trasmissione della malaria utilizzando una linea transgenica di Plasmodium berghei con luminescenza. Questo protocollo consente la determinazione precisa dell'IC50.

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in stretta conformità con le linee guida etiche e sono stati approvati dal Comitato Etico per l'Uso degli Animali dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo (CEUA-ICB/USP). Gli animali sono stati alloggiati e mantenuti nel rispetto degli standard stabiliti da questo comitato. Gli esperimenti sui parassiti geneticamente modificati Plasmodium , nonché la loro conservazione crioconservata a -80 °C, sono stati condotti in conformità con le normative stabilite dal Comitato Istituzionale di Biosicurezza dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo (CIBio-ICB/USP). In questo studio sono stati utilizzati un totale di tre topi femmina BALB/c, di età compresa tra 3 e 5 settimane, due infetti e uno non infetto.
1. Materiali e reagenti
<ol>
	<li>Preparare il terreno ookinete integrando RPMI 1640 con 0,025 M di HEPES, penicillina-streptomicina-neomicina (PSN), 50 mg/L di ipoxantina e 100 μM di acido xanturenico. Regolare il pH a 8,3 8,16.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavoro per il saggio di luminescenza mescolando 1 volume di substrato con 50 volumi del tampone di lisi fornito nel sistema di dosaggio della luciferasi.</li>
	<li>Impostare l'incubatrice a 21 °C.</li>
</ol>
2. Infezione e raccolta di sangue parassitato
<ol>
	<li>Infettare due topi femmina BALB/c (4-6 settimane di età) con 150 μL di ceppo crioconservato di Ookluc tramite iniezione intraperitoneale (IP) (Giorno 0). NOTA: In questo protocollo, raccomandiamo l'uso di topi BALB/c a causa della loro pronta disponibilità e dell'uso diffuso nelle strutture per animali. Tuttavia, qualsiasi ceppo di topo wild-type che sia suscettibile all'infezione da P. berghei e supporti la gametocitogenesi dovrebbe essere adatto per l'uso.</li>
	<li>A partire dal giorno 3, valutare la parassitemia e la gametocitemia mediante esame microscopico degli strisci di sangue colorati con Giemsa.</li>
	<li>Quando la parassitemia e la gametocitemia raggiungono circa il 5% e lo 0,5%, rispettivamente (di solito il giorno 4), raccogliere il sangue tramite puntura cardiaca utilizzando siringhe eparinizzate e raccogliere il sangue da entrambi i topi infetti. NOTA: Sebbene si tratti di una linea transgenica di P. berghei, il suo profilo di crescita e gametocitemia, sono simili a quelli osservati nel ceppo ANKA. In questo contesto, la proporzione di gametociti rispetto alla parassitemia totale è circa 10 volte inferiore. NOTA: Idealmente, la piastra composta (vedi sotto) viene preparata prima della raccolta del sangue parassitato, quindi il sangue viene pipettato sulla piastra immediatamente dopo la raccolta. Se il sangue del topo deve essere raccolto in un altro locale o non può essere immediatamente pipettato sulla piastra del composto per qualsiasi altro motivo, il sangue raccolto deve essere conservato a 37 °C per non più di 30 minuti.</li>
</ol>
3. Saggio di conversione - screening in piastre a 96 pozzetti
NOTA: Per garantire risultati coerenti, l'intero esperimento deve essere ripetuto tre volte in giorni diversi per confermare i risultati.
<ol>
	<li>Preparare i campioni composti utilizzando il terreno ookinete come diluente (una concentrazione finale di 10 μM). Diluire il materiale composto a 1 mM e preparare i campioni di lavoro diluendo il materiale da 1 mM 1:100 v:v in Ookinete Medium. Per un saggio in duplicato, preparare un volume finale di 200 μl di campione di lavoro.</li>
	<li>Se il composto è diluito in un solvente diverso dall'acqua, includere un campione di controllo contenente il solvente diluito in mezzo di ookinete nella stessa proporzione del campione da analizzare, in modo da garantire che l'eventuale inibizione osservata sia attribuibile al composto e non al solvente. NOTA: A titolo di esempio, esamineremo 90 composti.</li>
	<li>Utilizzando due piastre da 96 pozzetti, posizionare 80 μl dei campioni in ciascun pozzetto, come segue e illustrato nella Figura 1, in duplice (due piastre): Controllo positivo: 80 μl di terreno di ookinete; Controllo negativo: 80 μL di terreno ookinete; Controllo del solvente: 80 μl di terreno ookinete con DMSO all'1%; Campioni: 80 μL di 10 μM di ciascun composto in terreno ookinete.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig1.jpg"> 
Figura 1: Rappresentazione schematica di un layout di piastra a 96 pozzetti progettato per lo screening dei composti. Il layout della piastra include controllo positivo (C+), controllo negativo (C-), controllo più solvente di diluizione (C+S) e 90 composti di prova (S1-S90). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="4">
	<li>Aggiungere 4 μL di sangue di topo parassitato a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti con un rapporto v:v di 1:20, ad eccezione del controllo negativo (C-). Omogeneizzare delicatamente mediante pipettaggio. NOTA: Considerando le perdite, calcoliamo il fabbisogno di ~400 μL di sangue parassitato per ogni piastra.</li>
	<li>Per il controllo negativo, aggiungere sangue di topo non infetto in rapporto 1:20 (v:v, sangue:campione). Omogeneizzare delicatamente.</li>
	<li>Incubare a 21 °C per 6 ore o 24 ore. NOTA: l'attività di nLuc è rilevabile con 6 ore di incubazione e raggiunge il picco a 24 ore dal saggio8. Il test non è in grado di identificare i composti con attività dopo la formazione dello zigote, come i composti che inibiscono la morfogenesi dell'oocineta, perché gli zigoti formati accumuleranno nLuc indipendentemente dal completamento della morfogenesi. Pertanto, 6 ore di incubazione sono sufficienti per rilevare tutti i composti che bloccano l'attività di nLuc inibendo la gametogenesi, la ricombinazione sessuale o hanno citotossicità precoce. Tuttavia, normalmente preferiamo incubazioni di 24 ore per avere segnali più forti e un migliore rapporto segnale/rumore.</li>
</ol>
4. Saggio di luminescenza
<ol>
	<li>Dopo il periodo di incubazione, omogeneizzare i campioni pipettandoli su e giù per garantire un'accurata miscelazione del mezzo sanguigno.</li>
	<li>Preparare la miscela tampone di lisi/substrato di luciferasi immediatamente prima dell'uso in un rapporto 1:50 (v:v, substrato:tampone di lisi).</li>
	<li>Miscelare la miscela di substrato con i campioni in un rapporto 1:1 (v:v), garantendo una miscelazione delicata per evitare bolle. Incubare a 37 °C per 3-5 min. NOTA: In questo esempio, abbiamo aggiunto 84 μL di tampone substrato:lisi a ciascun pozzetto.</li>
	<li>Trasferire i campioni su una piastra bianca a fondo piatto a 96 pozzetti. Misura la luminescenza utilizzando un lettore di piastre. Utilizzare la seguente configurazione dei parametri: filtro di emissione: lente; intervallo di misurazione: 1 s per pozzetto.</li>
</ol>
5. Analisi dei dati - screening
<ol>
	<li>Dopo il test di luminescenza, prendere nota dei dati grezzi visualizzati (Figura 2). NOTA: Le unità di luce relativa (RLU) ottenute dipendono dal luminometro utilizzato. Nel nostro caso, i valori di RLU per il controllo positivo variavano da 10.000 a 500.000 in un test di incubazione di 24 ore. Tempi di incubazione più brevi (6 ore) si tradurranno in valori di RLU più bassi.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig2.jpg"> 
Figura 2: Risultati ottenuti da una lettura simulata di un saggio di conversione per lo screening dei composti. L'immagine mostra le letture di luminescenza simulate da un saggio eseguito dopo la conversione di oocinetes in presenza di un pannello di 90 composti. Valori più bassi dell'unità di luce relativa indicano una ridotta formazione di ookinete. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2">
	<li>Utilizzando un foglio di calcolo, calcola la media di ogni misurazione utilizzando la formula seguente. Sostituire XX con l'indirizzo della prima cella di misura e YY con l'indirizzo della seconda cella di misura. Ripetere la formula per tutti i campioni. =(MEDIA(XX:AA)</li>
	<li>Converti i dati in % di inibizione per una migliore analisi dei risultati. Nel foglio di calcolo, utilizza la formula seguente. Sostituire A con il valore RLU di esempio e B con il valore RLU di controllo. Ripetere la formula per tutti i composti testati: = 1 - (A/B) x 100 NOTA: I dati appariranno come mostrato nella Figura 3.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig3.jpg"> 
Figura 3: Risultati ottenuti da una lettura simulata di un saggio di conversione per lo screening dei composti rappresentati come % di inibizione per ciascun composto. Percentuale di inibizione della conversione per ciascun composto testato, calcolata come descritto sopra. I quadrati evidenziati indicano composti che promuovono oltre il 95% di inibizione della conversione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="4">
	<li>Identificare i composti che mostrano un'inibizione superiore al 95%. NOTA: Questi composti mostrano un'elevata attività contro gli stadi sessuali a una concentrazione di 10 μM. Nel nostro esempio, abbiamo trovato cinque composti con un'elevata attività contro gli stadi sessuali.</li>
	<li>Per i composti identificati, eseguire una determinazione IC50 come descritto di seguito.</li>
</ol>
6. Saggio di conversione - determinazione dell'IC 50
<ol>
	<li>Infettare i topi con Ookluc e raccogliere il sangue parassitato, come descritto nel paragrafo 2.</li>
	<li>Preparare i campioni utilizzando il terreno ookinete come diluente. Utilizzare una concentrazione iniziale alla quale si osserva un'inibizione del 100% della conversione da parte del composto. NOTA: Poiché i composti attivi sono stati identificati in uno screening con una concentrazione di 10 μM, utilizziamo 20 μM come concentrazione iniziale per la prima curva dose-risposta. Per una curva dose-risposta accurata, è importante che il test includa concentrazioni iniziali che determinano un'inibizione della conversione del 100% e concentrazioni finali che portano a un'inibizione dello 0%. Questo approccio garantisce un calcolo preciso dell'IC50 . La prima curva dose-risposta informerà le concentrazioni più basse del composto con un'inibizione del ~100%. In questo protocollo, utilizzeremo come esempio PyAz90, recentemente identificato utilizzando Ookluc13.</li>
	<li>In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere in triplicato (vedi Figura 4): Controllo positivo (C+): 80 μl di terreno ookinete; Controllo negativo (C-): 80 μl di terreno ookinete; Prima diluizione del campione (Cpd D1): 160 μL di composto a una concentrazione iniziale in terreno di ookinete che si traduce in un'inibizione della conversione del 100%; Pozzetti da D2 a D12: 80 μL di terreno di ookinete.</li>
	<li>Effettuare due diluizioni seriali pipettando 80 μL di pozzetto D1 in D2, omogeneizzare e pipettare 80 μL di pozzetto D2 in D3 e così via. Assicurarsi che tutti i pozzetti abbiano 80 μL di volume totale, quindi scartare gli ultimi 80 μL rimossi dal pozzetto D12. NOTA: Eseguire l'esperimento con almeno tre repliche per tutti i campioni, come indicato nella Figura 4. Per garantire l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati, l'intero esperimento deve essere ripetuto in tre giorni separati utilizzando ogni volta animali appena infetti. NOTA: Se nella prima schermata i risultati non mostrano alcun impatto del solvente nella conversione, non è necessario includere questi controlli nelle diluizioni seriali. In caso contrario, devono essere incluse anche le diluizioni seriali del solvente.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig4.jpg"> 
Figura 4: Layout della piastra a 96 pozzetti progettato per la determinazione del composto IC50 . Il layout della piastra include diluizioni a controllo positivo (C+), a controllo negativo (C-) e composto (Cpd) (da D1 a D12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="5">
	<li>Aggiungere sangue di topo parassitato alla piastra a 96 pozzetti a un v:v:1 di 1:20. Omogeneizzare delicatamente mediante pipettaggio. NOTA: A ciascun pozzetto verranno aggiunti un totale di 4 μL di sangue parassitato, ad eccezione del controllo negativo (C-). Considerando le perdite, calcoliamo la necessità di ~200 μL di sangue parassitato per ogni composto da testare.</li>
	<li>Nei pozzetti di controllo negativo, aggiungere sangue di topo non infetto con un rapporto 1:20 (v:v, sangue:campione). Omogeneizzare delicatamente.</li>
	<li>Incubare a 21 °C per 6 ore o 24 ore.</li>
	<li>Eseguire il test di luminescenza, come descritto nella sezione 4.</li>
</ol>
7. Analisi dei dati - Determinazione IC 50
NOTA: IC50 è definito come la concentrazione di un composto necessaria per inibire il 50% dell'attività/inibizione biologica. In questo test, l'inibizione si riferisce alla riduzione della conversione dell'ookinete. I dati sono rappresentati come una curva dose-risposta sigmoidale, dove l'asse X rappresenta la concentrazione del composto (log-trasformata) e l'asse Y rappresenta la % di inibizione.
<ol>
	<li>Calcolare la % di inibizione come descritto nella sezione 5, passaggio 5.3.</li>
	<li>Apri il software e crea una tabella XY.</li>
	<li>Impostare le opzioni dell'asse Y su Immettere 3 valori di replica in sottocolonne affiancate.</li>
	<li>Incollare i dati, con X che rappresenta la concentrazione del composto e Y che rappresenta la % di inibizione (Figura 5A).</li>
	<li>Nella barra dei menu, fare clic su Analizza e selezionare Regressione non lineare (adattamento della curva) e quindi Curve dose-risposta - Inibizione e [inibitore] rispetto alla risposta normalizzata - pendenza variabile; fare clic su OK.</li>
	<li>Nel pannello di sinistra, osservare la curva dose-risposta dei dati. Applica la personalizzazione desiderata, come i cambi di colore e i formati dei punti.</li>
	<li>Individuare la tabella di adattamento Nonlin per trovare l'IC50 calcolato e l'intervallo di confidenza al 95% (IC 95%) (Figura 5B).</li>
</ol>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig5.jpg"> 
Figura 5: Curva dose-risposta di PyAz90. La % di inibizione è stata misurata in funzione della concentrazione di PyAz90 (μM) su scala logaritmica. La curva sigmoidale rappresenta i dati approssimati utilizzati per determinare l'IC50, che era 0,013 μM (intervallo di confidenza al 95%: 0,012-0,014 μM). I punti dati rappresentano la media ± l'errore standard della media delle repliche sperimentali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<ol><li>World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024">https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024</a> (2025).</li>
<li>Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+biology+and+disease+pathogenesis%3A+insights+for+new+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments.</a> Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).</li>
<li>Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Vaccines%3A+From+the+Past+towards+the+mRNA+Vaccine+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era.</a> Vaccines. 11 (9), 1452(2023).</li>
<li>Ménard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+under+the+skin%3A+the+first+steps+in+malarial+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity.</a> Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).</li>
<li>Appetecchia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission-blocking+strategies+for+malaria+eradication%3A+Recent+advances+in+small-molecule+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development.</a> Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).</li>
<li>Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Plasmodium+falciparum+growth+assay+for+malaria+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).</li>
<li>Delves, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activities+of+current+antimalarial+drugs+on+the+life+cycle+stages+of+Plasmodium%3A+A+comparative+study+with+human+and+rodent+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites.</a> PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+the+pathogen+box+for+molecules+active+against+Plasmodium+sexual+stages+using+a+new+nanoluciferase-based+transgenic+line+of+P.+berghei+identifies+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+transmission-blocking+antimalarials+identified+by+high-throughput+screening+of+Plasmodium+berghei+Ookluc%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc.</a> Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).</li>
<li>Lima, M. N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+multi-kinase+approach+for+the+identification+of+potent+antiplasmodial+hits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits.</a> Front Chem. 7, 773(2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+chemogenomics+drug+repositioning+strategy+enables+the+discovery+of+epirubicin+as+a+new+repurposed+hit+for+Plasmodium+falciparum%C3%82%C2%A0and%C3%82%C2%A0P.+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparumÂ andÂ P. vivax.</a> Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).</li>
<li>Krishnan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torin+2+derivative%2C+NCATS-SM3710%2C+has+potent+multistage+antimalarial+activity+through+inhibition+of+P.+falciparum+phosphatidylinositol+4-kinase+%28Pf+ACS+Pharmacol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol).</a> Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+azepine+targets+the+Plasmodium+bc1+complex+and+displays+multistage+antimalarial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity.</a> JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).</li>
<li>Lima, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcones+as+a+basis+for+computer-aided+drug+design%3A+Innovative+approaches+to+tackle+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria.</a> Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4-aminoquinoline+chemotype+with+multistage+antimalarial+activity+and+lack+of+cross-resistance+with+PfCRT+and+PfMDR1+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants.</a> PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).</li>
<li>Blagborough, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+transmission+blockade+in+Plasmodium+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing transmission blockade in Plasmodium spp.</a> Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).</li>
<li>Azevedo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+method+for+in+vitro+screening+of+Plasmodium+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).</li>
<li>Gaitán, X. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+merozoite+thrombospondin+related+anonymous+protein+%28MTRAP%29+of+Plasmodium+berghei+as+a+transmission-blocking+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism versione 10.0.0 per Windows</td><td></td><td></td><td>Software GraphPad, Boston, Massachusetts, Stati Uniti</td></tr><tr><td>Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Termo Scientifico</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Ipoxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>Topi</td><td>---</td><td>---</td><td>Topi femmina BALB/c, di età compresa tra 3 e 5 settimane</td></tr><tr><td>Sistema di dosaggio della luciferasi nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina & meno; Streptomicina &minus; Soluzione di neomicina stabilizzata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre POLARStar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplemento</td><td>Termo Scientifico</td><td>61870036</td><td></td></tr><tr><td>Acido xanturenico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td></td></tr></tbody></table>

ookluc: una linea di plasmodium berghei per l'identificazione di composti che bloccano la trasmissione

Ookluc: A Plasmodium berghei Line for Identifying Transmission-blocking Compounds

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Malaria remains a world health challenge; in 2023, 263 million cases and 597,000 deaths were reported around the globe. The parasite's life cycle is ...

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Immunologia e Infezioni

Una volta che un gene è identificato come potenzialmente refrattaria per la malaria, deve essere valutato per il suo ruolo nella prevenzione delle infezioni da Plasmodium all'interno della zanzara. Questo protocollo illustra come l'entità delle infezioni plasmodio di zanzare possono essere analizzati. Le tecniche per la preparazione della coltura gametocyte, nutrendosi di sangue umano membrana zanzare, e saggio titoli virale nel midgut zanzara sono dimostrati.

Protocollo per Plasmodium falciparum infezioni in Fenotipo Determinazione Zanzare e infezione

Le zanzare che trasmettono la malaria hanno una serie di caratteristiche epidemiologicamente importanti che possono essere rilevate solo utilizzando tecniche molecolari. Utilizzando una piattaforma di genotipizzazione SNP basata su MALDI-TOF, abbiamo sviluppato un test per rilevare simultaneamente più tratti chiave (specie, resistenza agli insetticidi, infezione da parassiti e scelta dell'ospite) dei vettori della malaria.

Un test multi-rilevamento per la malaria Trasmissione Zanzare

Descriviamo un modello murino di malaria cerebrale sperimentale e mostriamo come la patologia infiammatoria e microvascolare possa essere monitorata in vivo utilizzando la risonanza magnetica.

Tracciamento in vivo di sviluppo dell&#39;edema e patologia microvascolare in un modello di malaria cerebrale sperimentale mediante l&#39;utilizzo di immagini a risonanza magnetica

A causa delle sorprendenti somiglianze del ciclo di vita e della biologia dei parassiti della malaria dei roditori con i parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei roditori sono diventati indispensabili per la ricerca sulla malaria. Qui, abbiamo standardizzato alcune delle tecniche più importanti utilizzate nell'analisi fenotipica di specie di malaria roditore selvatico e transgenico.

Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

Indagini dettagliate sugli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria sono fondamentali per progettare efficaci strategie di blocco della trasmissione. Questo protocollo dimostra come coltura efficacemente gametociti infettivi e quindi nutrire questi gametociti alle zanzare per generare stadi di zanzara di P. falciparum.

Plasmodium falciparum Coltura di gametociti e infezione da zanzare attraverso l'alimentazione artificiale della membrana

Utilizzo della fresatura a fascio ionico focalizzato per produrre lamelle vetrose su griglia da campioni biologici congelati a immersione per la tomografia crioelettronica.

Preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica

Questo protocollo descrive un test di immunoassorbimento enzimatico a sandwich per rilevare gli sporozoiti delle ghiandole salivari nelle zanzare. Utilizzando anticorpi monoclonali facilmente disponibili, il metodo consente di rilevare in modo economico e ad alto rendimento le zanzare portatrici di Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax. Il metodo è adatto per la ricerca sulla trasmissione della malaria, comprese le indagini sui vettori.

Rilevamento di Plasmodium Sporozoites nelle zanzare Anopheles utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico

Il test standard di alimentazione a membrana (SMFA) è considerato il gold standard per la valutazione e l'identificazione di potenziali composti antimalarici. Questo sistema di alimentazione artificiale viene utilizzato per infettare le zanzare per valutare ulteriormente gli effetti di tali composti sull'intensità e la prevalenza del parassita Plasmodium falciparum .

Test standard di alimentazione a membrana per la rilevazione dell'infezione da Plasmodium falciparum in vettori di zanzare Anopheles

Qui descriviamo un nuovo metodo per aiutare a chiarire i meccanismi dell'immunità cellulare al Plasmodium durante la fase ematica dell'infezione. Questo è un test in vitro che misura l'uccisione dei globuli rossi infetti da parte dei linfociti citotossici.

In vitro Saggio dell'uccisione dei globuli rossi infetti da plasmodio da parte di linfociti citotossici

La malaria si trasmette attraverso l'inoculazione dello stadio sporozoite di Plasmodium da parte di zanzare infette. Il Plasmodium transgenico ci ha permesso di comprendere meglio la biologia della malaria e ha contribuito direttamente agli sforzi di sviluppo del vaccino contro la malaria. In questo articolo descriviamo una metodologia semplificata per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei .

Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei

La genetica chimica prevede la sostituzione di un residuo gatekeeper con un amminoacido contenente una catena laterale diversa nel locus bersaglio. Qui, abbiamo generato un parassita mutante contenente un allele ipomorfico di cdpk1 e identificato le vie compensatorie adottate dal parassita nel background mutante.

Comprensione dello sviluppo di vie compensatorie in un parassita mutante della malaria che ospita allele ipomorfico di chinasi simili alle piante

Scopri un metodo di screening ad alto rendimento per identificare composti che bloccano la trasmissione della malaria utilizzando una linea transgenica di Plasmodium berghei con luminescenza. Questo protocollo consente la determinazione precisa dell'IC50.

Ookluc: una linea di Plasmodium berghei per l'identificazione di composti che bloccano la trasmissione

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