Ookluc: una linea di Plasmodium berghei per l'identificazione di composti che bloccano la trasmissione

La nostra ricerca mira a identificare e caratterizzare i composti che bloccano la trasmissione e i geni essenziali negli stadi sessuali del Plasmodium utilizzando un sistema ad alto rendimento per supportare nuove strategie per interrompere la trasmissione della malaria. Questo protocollo affronta la mancanza di metodi standardizzati e ad alto rendimento per identificare i composti che bloccano la trasmissione utilizzando una linea transgenica di P.berghei con rilevamento automatizzato in fase di luminescenza dello sviluppo di parassiti post-fecondazione. Questo protocollo consente lo screening degli stadi sessuali del Plasmodium, rileva precocemente i composti che bloccano la trasmissione e supporta la determinazione precisa di IC50, offrendo vantaggi rispetto ai metodi convenzionali.

Per iniziare, preparare i campioni di composto diluendo il materiale composto a un millimolare utilizzando un terreno di ookinete. Preparare i campioni di lavoro diluendo questo stock da un millimolare in terreno di ookinete in un rapporto di uno a 100 per ottenere una concentrazione finale di 10 micromolari. Per un test, preparare un volume finale di 200 microlitri di campione di lavoro in duplicato.

Se il composto è disciolto in un solvente diverso dall'acqua, preparare un campione di controllo diluendo il solvente nel mezzo di ookinete nella stessa proporzione utilizzata per il campione da analizzare. Utilizzando due piastre da 96 pozzetti, posizionare 80 microlitri di ciascun campione in pozzetti designati per il controllo positivo, il controllo negativo, il controllo del solvente e testare i campioni in duplicato seguendo lo schema indicato. Aggiungere quattro microlitri di sangue di topo parassitato a ciascun pozzetto con un rapporto di uno a 20, ad eccezione dei pozzetti di controllo negativo.

Omogeneizzare delicatamente pipettando su e giù. Per il controllo negativo, aggiungere sangue di topo non infetto a ciascun pozzetto con un rapporto di uno a 20 e omogeneizzare delicatamente mediante pipettaggio. Metti le piastre in un'incubatrice impostata a 21 gradi Celsius e incuba per sei ore o 24 ore.

Dopo l'incubazione, omogeneizzare ciascun campione pipettandolo su e giù per garantire una corretta miscelazione del terreno sanguigno. Preparare il tampone di lisi e la miscela di substrato di luciferasi in un rapporto di uno a 50 immediatamente prima dell'uso. Miscelare questa miscela di substrato tampone di lisi con ciascun campione in un rapporto uno a uno, garantendo una miscelazione delicata senza introdurre bolle.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. A questo punto, trasferire i campioni su una piastra bianca a fondo piatto a 96 pozzetti e misurare la luminescenza utilizzando un lettore di piastre. Dopo il test di luminescenza, registrare i dati grezzi di luminescenza visualizzati dal lettore di piastre.

Utilizzando un foglio di calcolo, calcola la media di ogni misurazione utilizzando la formula fornita. Sostituire XX con l'indirizzo della prima cella di misura e YY con l'indirizzo della seconda cella di misura. Ripetere la formula per tutti i campioni.

Converti i dati in percentuale di inibizione utilizzando la formula data, dove A è il valore dell'unità di luce relativa del campione e B è il valore dell'unità di luce relativa di controllo. Selezionare i composti che mostrano un'inibizione superiore al 95% per la determinazione della concentrazione inibitoria del 50%. Dopo aver infettato i topi con Ookluc e raccolto il sangue parassitato, preparare campioni composti utilizzando il terreno ookinete come diluente alla concentrazione iniziale che ha mostrato un'inibizione della conversione del 100%.

Pipettare i campioni in triplicato in una piastra a 96 pozzetti seguendo il layout specificato. Utilizzando una pipetta, eseguire due diluizioni seriali trasferendo 80 microlitri dal pozzetto D1 a D2, mescolando accuratamente, quindi trasferendo 80 microlitri da D2 a D3 e continuando questo processo fino a D12. Scartare gli ultimi 80 microlitri rimossi da D12 per mantenere 80 microlitri per pozzetto.

A questo punto, aggiungere il sangue di topo parassitato a ciascun pozzetto con un rapporto di uno a 20 e omogeneizzare delicatamente mediante pipettaggio. Nei pozzetti di controllo negativo, aggiungere sangue di topo non infetto in un rapporto di uno a 20 e omogeneizzare delicatamente. Posizionare la piastra in un incubatore impostato a 21 gradi Celsius e incubare per sei o 24 ore prima di eseguire il test di luminescenza.

Dopo aver calcolato l'inibizione percentuale, aprire il software di analisi e creare una tabella XY per il tracciamento. Impostare l'asse y per immettere tre valori di replica in sottocolonne affiancate. Incolla i dati nella tabella con x che rappresenta la concentrazione del composto e y che rappresenta la percentuale di inibizione.

Ora fai clic su Analizza. Selezionare Regressione non lineare, adattamento della curva, quindi scegliere Curve dose-risposta, Inibizione, seguito da Inibitore rispetto alla risposta normalizzata, pendenza variabile e fare clic su OK. Visualizza la curva dose-risposta sul pannello di sinistra e applica personalizzazioni, come modifiche al colore o al formato dei punti.

Individuare la tabella di adattamento non lineare per trovare l'IC50 calcolato e l'intervallo di confidenza del 95%. La pirimidina azepina 90 ha dimostrato una chiara inibizione concentrazione-dipendente dell'attività bersaglio con un'inibizione superiore al 95% osservata a concentrazioni da 0,125 a un micromolare e una completa perdita di attività inferiore a 0,007 micromolare, suggerendo un forte effetto soglia nella sua risposta inibitoria. La curva dose-risposta adattata ai dati della pirimidina azepina 90 ha prodotto un valore IC50 di 0,013 micromolare, indicando un'elevata potenza nell'inibire l'attività mirata.