Dissezione rapida e dissociazione dell'epitelio olfattivo di topo per sospensioni a nucleo singolo
1 agosto 2025
Questo articolo fornisce un protocollo semplificato per la dissezione e la dissociazione dell'epitelio olfattivo murino ai fini del sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo.
Qui forniamo un protocollo progettato per assistere con la rapida dissezione dell'epitelio olfattivo ai fini del sequenziamento di singole cellule o singoli nuclei. Il nostro protocollo dà priorità alla velocità e alla facilità di apprendimento ed è ideale per applicazioni su singole cellule in cui il tessuto è omogeneizzato e la dissezione rapida è più importante che preservare l'integrità anatomica, a differenza dei metodi precedenti. Il nostro protocollo consente una dissezione rapida e facile da usare dell'epitelio olfattivo, con l'obiettivo di facilitare gli studi di sequenziamento di singole cellule e promuovere la ricerca sulle basi genetiche del sistema olfattivo.
Per iniziare, procurati la testa spelleta di un topo. Usa un paio di forbici sottili e affilate per praticare due incisioni per rompere bilateralmente gli archi zigomatici dall'osso squamoso posizionando una punta delle forbici nell'orbita posteriore e l'altra adiacente al canale uditivo. Praticare un'incisione superficiale da un'orbita all'altra lungo l'aspetto più anteriore dell'osso frontale, incidendo solo la superficie dorsale dell'osso frontale a una profondità di circa uno o due millimetri.
Ora, tagliare lungo la linea mediana del cranio dal forame magno attraverso le suture sagittale e interfrontale fino a raggiungere l'incisione interorbitale praticata in precedenza. Inserire un paio di pinze nell'incisione della linea mediana e tirare con decisione lateralmente un emisfero della volta cranica. Mentre si tiene l'osso nasale e i denti incisivi, usare una pinza per staccare la volta cranica controlaterale.
Consentire al cervello, compresi i bulbi olfattivi, di essere rimosso con l'emisfero osseo mentre viene strappato via. Quindi, utilizzare tronchesi ossei o Rongeurs per rimuovere l'osso frontale e l'osso premascellare rimanenti fino alla base dei denti incisivi. Tagliare lungo la sutura frontonasale con tronchesi ossei per liberare l'osso nasale dalla placca cribrosa.
Quindi usa una pinza per sollevare l'osso nasale dalla placca cribrosa per esporre l'epitelio olfattivo. Se l'osso premascellare residuo ostruisce l'epitelio olfattivo dorsale, rimuoverlo prima di procedere. Ora, usa un paio di pinze a punta fine per fissare delicatamente l'aspetto dorsale del setto nasale alla sua giunzione con la placca cribrosa e tiralo posteriormente.
L'epitelio olfattivo principale si libererà come una struttura completamente intatta. La citometria a flusso per immagini ha identificato che il 53,69% di tutti gli eventi erano nuclei. Tra i singoli nuclei, il 53,89% presentava un'elevata circolarità.
I grafici di controllo della qualità hanno confermato la qualità costante del sequenziamento su quattro campioni, con distribuzioni uniformi della conta genica e mitocondriale. I geni marcatori del set di dati sono coerenti con molti dei geni marcatori consolidati per ciascun tipo di cellula.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per la rapida dissezione e dissociazione dell'epitelio olfattivo murino, finalizzato a facilitare il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo. Il metodo privilegia la velocità e la semplicità di esecuzione, risultando adatto ad applicazioni in cui è necessaria l'omogeneizzazione del tessuto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Genomica
- Ricerca sul sistema olfattivo
Contesto
- Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e a singolo nucleo è fondamentale per comprendere la diversità cellulare.
- I metodi di dissezione precedenti enfatizzavano l'integrità anatomica, che potrebbe non essere ideale per alcune applicazioni.
- L'epitelio olfattivo svolge un ruolo fondamentale nella trasduzione sensoriale olfattiva.
- Migliorare le tecniche di dissezione può aumentare l'efficienza degli studi genetici relativi all'olfatto.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo semplice da utilizzare per la dissezione dell'epitelio olfattivo.
- Facilitare l'elaborazione rapida dei tessuti per indagini di sequenziamento a singola cellula.
- Promuovere la ricerca sui meccanismi genetici del sistema olfattivo.
Metodi Utilizzati
- Il metodo prevede la dissezione dell'epitelio olfattivo da modelli murini.
- Questo modello biologico coinvolge il sistema olfattivo del topo, sottolineando la necessità di un'estrazione rapida.
- La rimozione delle ossa e una manipolazione accurata garantiscono l'integrità dell'epitelio olfattivo principale.
- I passaggi chiave includono incisioni nella volta cranica ed estrazione delle strutture olfattive.
- Sono stati implementati controlli di qualità per mantenere una qualità costante del sequenziamento.
Risultati principali
- Oltre la metà degli eventi raccolti è stata identificata come nuclei, indicando un isolamento riuscito.
- L'elevata circularità dei nuclei suggerisce una buona conservazione durante la dissezione.
- Il controllo di qualità ha dimostrato distribuzioni uniformi di geni e mitocondri.
- I geni marcatore erano allineati con i parametri consolidati per i tipi cellulari.
Conclusioni
- Lo studio presenta un rapido progresso metodologico per la dissezione dell'epitelio olfattivo.
- Permettendo un sequenziamento efficiente a singolo nucleo, contribuisce alla comprensione dei fattori genetici nell'olfatto.
- Questo protocollo potrebbe migliorare l'analisi dei meccanismi neuronali e della plasticità nei sistemi sensoriali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La preparazione rapida e riproducibile di sospensioni di singoli nuclei dall'epitelio olfattivo del topo consente il profilo molecolare ad alta risoluzione di popolazioni neuronali e progenitrici diverse. Questo protocollo affronta un collo di bottiglia chiave nella genomica single-cell riducendo al minimo il tempo di estrazione del tessuto e preservando l'integrità nucleare, sostenendo una valida conferma degli obiettivi e una riduzione efficace dei rischi meccanicistici nei flussi di lavoro delle neuroscienze sensoriali. L'approccio aumenta la fiducia predittiva nella ricerca traslazionale e nella fase iniziale della scoperta focalizzata sulla base genetica della funzione olfattiva e della rigenerazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente un rapido test delle ipotesi sull'espressione genica nei neuroni sensoriali olfattivi e nelle cellule progenitrici.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio preservando la qualità nucleare per il sequenziamento successivo.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico dei percorsi candidati coinvolti nel ricambio dei neuroni sensoriali.
- Migliora la fiducia predittiva nella selezione dei bersagli nella ricerca sui sistemi sensoriali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce sospensioni di singoli nuclei di alta qualità, adatte per flussi di lavoro standardizzati di sequenziamento a singola cellula.
- Garantisce riproducibilità e scalabilità su più campioni e ripetizioni sperimentali.
- Fornisce output quantitativi, inclusi resa nucleare e parametri di qualità, per la valutazione del dosaggio.
- Permette una valutazione affidabile delle variazioni dell'espressione genica in risposta a perturbazioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli pertinenti per lo studio della disfunzione olfattiva e della rigenerazione.
- Consente un percorso continuo dalla genomica di scoperta alla validazione preclinica di bersagli molecolari.
- Riduce il rischio biologico fornendo dati coerenti e di alta qualità per l'identificazione di biomarcatori traslazionali.
- Semplifica le decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio nei portafogli di neuroscienze sensoriali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si integra nell'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, consentendo una transizione fluida dall'estrazione del tessuto al sequenziamento di singoli nuclei e alle analisi successive.
- Biologia della scoperta: Accelera la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nella ricerca sul sistema olfattivo.
- Screening: Fornisce sospensioni nucleari pronte per il saggio con parametri di qualità validati.
- Analisi: Offre letture quantitative per confrontare l'espressione genica tra diversi tipi cellulari e condizioni.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori e lo sviluppo di modelli preclinici per i disturbi olfattivi.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e riutilizzabile per la preparazione di singoli nuclei in tessuti sensoriali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la capacità di elaborazione nella genomica a singola cellula.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione/cessazione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento, corretti per il rischio, dei programmi di neuroscienze sensoriali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze tecniche nella dissezione rapida e nell'isolamento di nuclei da strutture anatomiche complesse.
- Richiede l'accesso a strumentazione specializzata per l'elaborazione dei tessuti e il controllo di qualità (ad esempio, citometria a flusso con imaging).
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità tra studi e operatori.
- Potrebbe richiedere adattamenti per l'utilizzo con altri tipi di tessuto o sistemi modello dotati di caratteristiche anatomiche diverse.
- L'estrazione focalizzata sulla velocità potrebbe limitare le applicazioni in cui l'integrità anatomica è fondamentale.
