Name: Dissezione rapida e dissociazione dellepitelio olfattivo di topo per sospensioni a nucleo singolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Scopri la dissezione rapida dell'epitelio olfattivo di topo per ottenere sospensioni a nucleo singolo. Questo metodo facilita lo studio del sistema olfattivo mediante sequenziamento RNA a singolo nucleo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tutti gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati e condotti in conformità con il Baylor College of Medicine IACUC. Sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J (JAX:000664). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Dissezione dell'epitelio olfattivo
<ol>
	<li>Inizia anestetizzando profondamente il topo utilizzando qualsiasi metodo preferito (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con un fermo pizzicamento delle dita dei piedi e procedere con la perfusione transcardiaca di almeno 10 ml di 1x PBS ghiacciato. Rimuovere la pelle per esporre il cranio (Figura 2A). NOTA: La rimozione della testa dal corpo è facoltativa. Se si decide di rimuovere la testa, si consiglia di rimuovere la pelle e gli altri tessuti molli intorno al cranio prima della decapitazione.</li>
	<li>Usando un paio di forbici sottili e affilate, praticare due incisioni per rompere bilateralmente gli archi zigomatici dall'osso squamoso posizionando una punta delle forbici nell'orbita posteriore e l'altra adiacente al canale uditivo (linee verdi nella Figura 2B).</li>
	<li>Praticare un'incisione superficiale da un'orbita all'altra lungo l'aspetto più anteriore dell'osso frontale. Incidere solo la superficie dorsale dell'osso frontale (~1-2 mm di profondità), facendo attenzione a non tagliare le strutture sottostanti o le ossa che compongono l'orbita (linea blu nella Figura 2B). NOTA: Per ottenere un'incisione poco profonda tra le orbite, tenere le forbici perpendicolari al cranio e utilizzare solo le punte affilate per tagliare.</li>
	<li>Tagliare lungo la linea mediana del cranio dal forame magno, attraverso le suture sagittale e interfrontale, fino a raggiungere l'incisione interorbitale praticata nell'osso frontale nel passaggio 1.3 (linea rossa nella Figura 2B).</li>
	<li>Inserire un paio di pinze nell'incisione praticata lungo la linea mediana del cranio e tirare con decisione lateralmente un emisfero della volta cranica. Questa azione rimuoverà anche le ossa dell'orbita (frontale, mascellare e lacrimale), esponendo gli aspetti laterali dei turbinati olfattivi (Figura 2D). NOTA: Fare attenzione a non danneggiare inavvertitamente l'OE da questo punto in poi.</li>
	<li>Tenendo l'osso nasale e i denti incisivi, staccare la volta cranica controlaterale usando una pinza. Lasciare che il cervello (compresi i bulbi olfattivi) venga rimosso con l'emisfero osseo mentre viene strappato via (Figura 1E). Le uniche strutture ossee visibili che dovrebbero rimanere dopo questo passaggio sono la base del cranio e le ossa che circondano l'OE (Figura 2F).</li>
	<li>Utilizzando un paio di tronchesi ossei o rongeurs, rimuovere l'osso frontale e l'osso premascellare (incisivo) rimanenti fino alla base dei denti incisivi (Figura 2G).</li>
	<li>Utilizzare tronchesi ossei per tagliare lungo la sutura frontonasale per rilasciare l'osso nasale dalla placca cribrosa, prestando estrema attenzione a non danneggiare l'OE sottostante esposto o fratturare la placca cribrosa.</li>
	<li>Sollevare l'osso nasale dalla placca cribrosa usando una pinza per esporre l'OE (Figura 2H). Se l'osso premascellare residuo oscura l'OE dorsale, rimuoverlo prima di procedere (cerchi neri nella Figura 1I).</li>
	<li>Utilizzando una pinza a punta fine, fissare delicatamente l'aspetto dorsale del setto nasale alla sua giunzione con la placca cribrosa e tirare posteriormente (Figura 2J, K). Con una resistenza minima, l'epitelio olfattivo principale si libererà come una struttura completamente intatta (Figura 2L).</li>
	<li>Procedere immediatamente con la dissociazione OE o congelare il tessuto per una successiva elaborazione.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig2.jpg"> 
Figura 2: Tecnica per la dissezione rapida dell'epitelio olfattivo. (A) La testa del topo dopo la rimozione del tessuto molle circostante. (B) Guide con codice colore per incisioni della volta cranica. (C) Aspetto a seguito di incisioni della volta cranica. (D) Rimozione del primo emisfero della volta cranica insieme alla porzione dell'orbita adiacente all'epitelio olfattivo. (E) Rimozione della porzione controlaterale della volta cranica insieme al cervello. (F) La testa dopo la rimozione del cervello e della volta cranica. (G) Rimozione dell'osso frontale più anteriore e della premascella posteriore, a seguito di incisione sulla sutura frontomascellare. (H) Rimozione delle ossa nasali. (I) I cerchi neri evidenziano le aree dell'osso premascellare residuo che possono essere opzionalmente rimosse. (J) Posizionamento di pinze per la rimozione dell'epitelio olfattivo intatto. (K) Tirare posteriormente per rilasciare l'epitelio olfattivo. (L) Rilascio totale dell'epitelio olfattivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Dissociazione dell'epitelio olfattivo e isolamento del singolo nucleo
<ol>
	<li>Posizionare una provetta C e due provette coniche da 15 mL per campione sul ghiaccio.</li>
	<li>Preparare il tampone di lisi aggiungendo l'inibitore dell'RNAsi (a una concentrazione finale di 0,2 U/μL) al tampone di estrazione dei nuclei prefabbricati.</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di BSA all'1% a ciascuna provetta conica da 15 mL, agitare brevemente ed eliminare l'eccesso. Questo riveste ciascuna delle provette coniche da 15 mL con BSA per ridurre al minimo l'adesione dei nuclei alla provetta.</li>
	<li>Per un intero OE, aggiungere 2 mL di tampone di lisi ghiacciato a ciascuna provetta C.</li>
	<li>Aggiungere campioni OE ai tubi C. Usando una pinza #2, tieni ogni campione sopra il rispettivo tubo C e taglialo in piccoli pezzi usando un paio di forbici a punta fine.</li>
	<li>Posizionare le provette a C contenenti ciascun campione capovolte sui blocchi dissociatori tissutali automatizzati. Nella schermata del dissociatore, il quadrato corrispondente a ciascun blocco cambierà da Libero a Selezionato.</li>
	<li>Premere l'icona della cartella per accedere alla cartella Miltenyi . Utilizzando le frecce, scorrere fino al programma 4C_nuclei_1 (un programma precaricato all'interno del dissociatore). Premere OK per applicare il programma a ciascun blocco, quindi premere Avvio per iniziare il ciclo. Rimuovere i tubi C dal dissociatore immediatamente dopo il completamento del ciclo. NOTA: Se possibile, mantenere i tubi C ghiacciati durante il ciclo di dissociazione. È importante rimuovere i campioni dal dissociatore immediatamente dopo il completamento del ciclo e procedere con le fasi successive del protocollo per evitare un'eccessiva lisi dei nuclei.</li>
	<li>Con una pipetta, aspirare la sospensione omogeneizzata dalla provetta C e filtrarla attraverso un filtro da 70 μm nella prima provetta conica rivestita in BSA. Evitare di aspirare i frammenti ossei che si sono accumulati sul fondo del tubo corbitale.</li>
	<li>Sciacquare il colino con 1 ml di 1 PBS ghiacciato per garantire una filtrazione completa.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione filtrata a 500 × g per 5 minuti a 4 °C in una centrifuga a secchiello oscillante.</li>
	<li>Aspirare delicatamente ed eliminare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere completamente il pellet di nuclei in 1 mL di 1x PBS ghiacciato mediante pipettaggio delicato.</li>
	<li>Passare i nuclei risospesi attraverso un filtro da 30 μm nel secondo tubo conico rivestito in BSA. La concentrazione dei nuclei può essere quantificata utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.</li>
	<li>Procedere immediatamente con il protocollo a valle scelto (con o senza FACS) per preservare l'integrità del campione e prevenire la degradazione (Figura 3). NOTA: Si consiglia vivamente agli utenti di eseguire le prove dell'intero protocollo per garantire un completamento continuo e tempestivo.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig3.jpg"> 
Figura 3: Flusso di lavoro di dissociazione dell'epitelio olfattivo e isolamento a nucleo singolo. Dopo la dissezione, l'epitelio olfattivo viene dissociato meccanicamente e chimicamente. Il lisato viene quindi filtrato attraverso un colino da 70 μm, risciacquato con 1x PBS e centrifugato a 500 × g per 5 minuti. Il pellet viene risospeso in 1x PBS prima di essere filtrato attraverso un filtro da 30 μm. La sospensione di nuclei risultante è disponibile per varie applicazioni di sequenziamento a valle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<ol><li>Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+I.+Morphological+aspects+of+differentiation+and+structural+organization+of+the+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons.</a> J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).</li>
<li>Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+II.+Degeneration+and+reconstitution+of+the+olfactory+sensory+neurons+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. II. Degeneration and reconstitution of the olfactory sensory neurons after axotomy.</a> J Neurocytol. 8 (2), 197-213 (1979).</li>
<li>Caggiano, M., Kauer, J. S., Hunter, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globose+basal+cells+are+neuronal+progenitors+in+the+olfactory+epithelium%3A+a+lineage+analysis+using+a+replication-incompetent+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Globose basal cells are neuronal progenitors in the olfactory epithelium: a lineage analysis using a replication-incompetent retrovirus.</a> Neuron. 13 (2), 339-352 (1994).</li>
<li>Iwai, N., Zhou, Z., Roop, D. R., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+basal+cells+are+multipotent+progenitors+in+normal+and+injured+adult+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Horizontal basal cells are multipotent progenitors in normal and injured adult olfactory epithelium.</a> Stem Cells. 26 (5), 1298-1306 (2008).</li>
<li>Schwob, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells+of+the+mammalian+olfactory+epithelium%3A+Taking+poietic+license%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: Taking poietic license.</a> J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+olfactory+stem+cell+trajectories+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstructing olfactory stem cell trajectories at single-cell resolution.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 817-830.e8 (2017).</li>
<li>Gadye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+activates+transient+olfactory+stem+cell+states+with+diverse+lineage+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury activates transient olfactory stem cell states with diverse lineage capacities.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 775-790.e9 (2017).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deconstruction+of+mouse+olfactory+sensory+neurons%3A+from+whole+mucosa+to+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: from whole mucosa to single-cell RNA-seq.</a> Sci Rep. 5 (1), 18178(2015).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+olfactory+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation.</a> Neuron. 72 (5), 748-759 (2011).</li>
<li>Brann, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+expression+of+SARS-CoV-2+entry+genes+in+the+olfactory+system+suggests+mechanisms+underlying+COVID-19-associated+anosmia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia.</a> Sci Adv. 6 (31), eabc5801(2020).</li>
<li>Carter, L. A., MacDonald, J. L., Roskams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+horizontal+basal+cells+demonstrate+a+conserved+multipotent+progenitor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype.</a> J Neurosci. 24 (25), 5670-5683 (2004).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Sci Rep. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Ruiz Tejada Segura, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+transcriptomics+atlas+of+the+mouse+nose+sheds+light+on+the+anatomical+logic+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A 3D transcriptomics atlas of the mouse nose sheds light on the anatomical logic of smell.</a> Cell Rep. 38 (12), 110547(2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+census+of+mammalian+olfactory+epithelium+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging.</a> Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).</li>
<li>Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+manual+deboning+method+to+prepare+intact+mouse+nasal+tissue+with+preserved+anatomical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization.</a> J Vis Exp. (78), e50538(2013).</li>
<li>Gurumurthy, R. K., Kumar, N., Chumduri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+isolation+of+high-quality+single+cells+from+the+female+mouse+reproductive+tract+tissues+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for isolation of high-quality single cells from the female mouse reproductive tract tissues for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100970(2021).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Belfort, B. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+AAV+serotypes+for+transduction+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of AAV serotypes for transduction of olfactory sensory neurons.</a> Front Neurosci. 19, 1531122(2025).</li>
<li>Huang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+olfactory+sensory+neurons+provide+behaviourally+relevant+sensory+input+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immature olfactory sensory neurons provide behaviourally relevant sensory input to the olfactory bulb.</a> Nat Commun. 13 (1), 6194(2022).</li>
<li>Barrios, A. W., Nunez, G., Sanchez Quinteiro, P., Salazar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+the+olfactory+subsystems+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Anatomy, histochemistry, and immunohistochemistry of the olfactory subsystems in mice.</a> Front Neuroanat. 8, 63(2014).</li>
<li>Antunes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+nasal+septa+for+respiratory+epithelial+air-liquid+interface+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures.</a> Biotechniques. 43 (2), 195-204 (2007).</li>
<li>Wu, J., Cai, Y., Wu, X., Ying, Y., Tai, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Bakulski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+gene+expression+effects+of+developmental+lead+%28Pb%29+exposure+on+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the gene expression effects of developmental lead (Pb) exposure on the mouse hippocampus.</a> Toxicol Sci. 176 (2), 396-409 (2020).</li>
<li>Chang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+uncovers+the+individual+alteration+of+intestinal+mucosal+immunocytes+in+Dusp6+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing uncovers the individual alteration of intestinal mucosal immunocytes in Dusp6 knockout mice.</a> iScience. 25 (2), 103738(2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-sequencing+profiling+of+mouse+lung.+Reduced+dissociation+bias+and+improved+rare+cell-type+detection+compared+with+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-sequencing profiling of mouse lung. Reduced dissociation bias and improved rare cell-type detection compared with single-cell RNA sequencing.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).</li>
<li>Xiong, A., Zhang, J., Chen, Y., Zhang, Y., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+single-cell+transcriptomic+analyses+reveal+that+GPNMB-high+macrophages+promote+PN-MES+transition+and+impede+T+cell+activation+in+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM.</a> eBioMedicine. 83, 104239(2022).</li>
</ol>

L'epitelio olfattivo murino (OE) è un componente essenziale del sistema olfattivo ed è responsabile della rilevazione e della trasduzione dei segnali odorosi nel sistema nervoso centrale. Il suo strato più superficiale contiene le ciglia che rilevano gli odori dei neuroni sensoriali olfattivi, che sono ricoperti da uno strato di muco e circondati dalle cellule sustentacolari e microvillari di supporto 1,2. Gli OSN sono bipolari, estendono le loro ciglia apicalmente per formare un reticolo all'interno dello strato di muco e i loro assoni basalmente attraverso la placca cribrosa ossea per fondersi in glomeruli all'interno del bulbo olfattivo. Questi glomeruli sono il sito delle sinapsi tra gli OSN e i neuroni a valle. Sottostanti le OSN, le cellule progenitrici neuronali chiamate cellule basali globose riforniscono costantemente le OSN mentre muoiono3 in seguito all'esposizione diretta a insulti ambientali come tossine trasportate dall'aria, agenti patogeni e traumi fisici. Le cellule basali globose derivano da un pool di riserva di cellule basali orizzontali multipotenti 4,5, situate più basalmente e aderenti alla lamina basale delle sporgenze ossee chiamate turbinati nasali. I turbinati nasali sono tortuosi, rendendo l'OE difficile da separare e omogeneizzare. Inoltre, l'OE è circondato da ossa del cranio, rendendo l'accesso all'area difficile e tradizionalmente richiede una procedura che richiede molto tempo.
Studi precedenti si sono basati su un'incubazione prolungata della papaina per rilasciare l'epitelio olfattivo dall'osso 6,7,8,9,10, che può ritardare ulteriormente l'elaborazione a valle della sospensione a singola cellula. Poiché il taglio degli assoni OSN innesca l'apoptosi11, è fondamentale ridurre al minimo il tempo che intercorre tra l'estrazione del tessuto e la preparazione della libreria di cDNA. Inoltre, l'architettura dell'OE e le sue proiezioni sul bulbo olfattivo complicano l'estrazione di cellule intatte per il successo del sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Fortunatamente, il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) è emerso come un potente strumento per profilare le cellule preservando la distribuzione del tipo cellulare, in particolare nei tessuti in cui la dissociazione di singole cellule è difficile opoco pratica.
Mentre un certo numero di studi 6,7,8,10,14,15 hanno eseguito il sequenziamento di singole cellule dell'OE di topo, nessuno offre una procedura di dissezione dettagliata ottimizzata per una raccolta di tessuti coerente e conveniente, che è necessaria data la fragilità dell'OE e l'involucro da varie ossa del cranio. Inoltre, le guide di dissezione esistenti16 si concentrano sulla conservazione della struttura anatomica piuttosto che sulla velocità, portando a tempi di dissezione potenzialmente lunghi. Poiché una preparazione tissutale opportuna è essenziale per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA e massimizzare la qualità dei nuclei preparati17,18, è necessario un protocollo ottimizzato per la rapida dissezione e omogeneizzazione dell'OE murino in una sospensione a nucleo singolo per l'uso in varie applicazioni a valle.
Questo protocollo (Figura 1) presenta un metodo semplificato progettato per superare queste sfide, consentendo la rapida dissezione dell'OE murino e un'efficiente dissociazione del tessuto allo scopo di isolare i nuclei. Questo approccio facilita il sequenziamento di un singolo nucleo di alta qualità19, fornendo una tecnica affidabile per studiare le basi molecolari della biologia olfattiva.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig1.jpg"> 
Figura 1: Anatomia delle suture e delle ossa rilevanti del cranio di topo C57BL/6 e sezione trasversale rappresentativa dell'epitelio olfattivo. (A) Le suture del cranio sono codificate a colori. Le suture sono codificate a colori su un lato del cranio, mentre l'altro lato non è contrassegnato per riferimento (a sinistra). I nomi delle suture sono codificati a colori di conseguenza (a destra). (B) Ossa del cranio codificate a colori. Le ossa sono codificate a colori su un lato del cranio, mentre l'altro lato non è contrassegnato per riferimento (a sinistra). I nomi delle ossa sono codificati a colori di conseguenza (a destra). (C) Sezione trasversale della porzione centrale dell'OE (sezionata utilizzando il metodo descritto in questo articolo) con turbinati codificati a colori su un lato e l'over a sinistra non contrassegnato per riferimento (a sinistra). Nomi dei turbinati visualizzati (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 ml</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Tronchesino d'osso&nbsp;</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>16102-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iride in miniatura Bonn&nbsp;</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>18-1392</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Codice: A1595</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont #3</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Topi femmina C57BL/6J</td><td>Il laboratorio Jackson</td><td>JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>delicati tubi MACS C&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociatore Octo&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Filtri MACS SmartStrainer 30 um&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers 70 um&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Micro Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di estrazione dei nuclei&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-128-024</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x senza calcio e magnesio, PH 7,4 &plusmn; 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore dell'RNAsi protettore&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata Sorvall Legend XTR</td><td>Termo Scientifico</td><td>50119927-5</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione rapida e dissociazione dell'epitelio olfattivo di topo per sospensioni a nucleo singolo

Rapid Dissection and Dissociation of the Mouse Olfactory Epithelium for Single-Nucleus Suspensions

Per fornire un contesto anatomico per la dissezione e l'analisi, le suture e le ossa del cranio di topo C57BL/6, nonché la porzione centrale dell'epitelio olfattivo (OE), sono state visualizzate e codificate a colori (Figura 1). Un lato di ogni immagine è stato annotato per evidenziare suture, ossa e turbinati rilevanti, mentre l'altro lato è stato lasciato non contrassegnato come riferimento. La sezione trasversale OE è stata preparata seguendo i protocolli stabiliti20</su...

Dissezione rapida e dissociazione dell'epitelio olfattivo di topo per sospensioni a nucleo singolo

The murine olfactory epithelium is the initial entry point of the olfactory system, housing various cell types that include olfactory sensory neurons, ...

rapid-dissection-dissociation-mouse-olfactory-epithelium-for-single

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Fotolisi di composti in gabbia permette la produzione di un rapido aumento e localizzato della concentrazione di vari composti fisiologicamente attivi. Qui mostriamo come ottenere patch-clamp registrazioni combinate con fotolisi di cAMP in gabbia o in gabbia Ca per lo studio della trasduzione olfattiva in dissociato topo neuroni sensoriali olfattivi.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Il video dimostra l'isolamento di motoneuroni oculomotori, trocleari e spinali da un embrione di topo transgenico. L'embrione esprime motoneuroni marcati con una proteina fluorescente verde (GFP) per una facile visualizzazione e identificazione. I motoneuroni vengono isolati chirurgicamente al microscopio a fluorescenza e mantenuti in un terreno di coltura.

Isolamento e coltura di motoneuroni oculomotori, trocleari e spinali da un embrione di topo

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule primarie degli oligodendrociti da una sospensione di cellule neurali ottenuta da un cucciolo di topo utilizzando la separazione magnetica. La tecnica impiega biglie magnetiche rivestite con anticorpi specifici per gli antigeni degli oligodendrociti, consentendo l'isolamento selettivo di queste cellule.

Isolamento di oligodendrociti primari murini mediante microsfere immunomagnetiche

Questo video mostra la registrazione elettrofisiologica dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) nei topi utilizzando una tecnica di patch-clamp perforata. L'epitelio olfattivo, contenente OSN con recettori degli odori marcati con fluorofori, viene isolato da un topo e fissato in una camera di registrazione. Una pipetta di registrazione è fissata alla manopola dendritica di un OSN e la nistatina all'interno della pipetta perfora la membrana per formare la connettività elettrica con la cellula.

Registrazione perforata con patch-clamp dei neuroni sensoriali olfattivi nei topi

Le ciglia dei neuroni sensoriali olfattivi contengono proteine della cascata di trasduzione del segnale, ma un'analisi spaziale dettagliata della loro distribuzione è difficile nelle criosezioni. Descriviamo qui un approccio ottimizzato per la marcatura dell'intera montatura e la visualizzazione en face delle proteine ciliari.

Tutta Monte Etichettatura del Cilia nel Main olfattivo Sistema di Mice

L'analisi delle proprietà fisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi incontra ancora limitazioni tecniche. Qui li registriamo attraverso un patch-clamp perforato in una preparazione intatta dell'epitelio olfattivo in topi geneticamente mirati. Questa tecnica consente la caratterizzazione delle proprietà di membrana e delle risposte a specifici ligandi di neuroni che esprimono recettori olfattivi definiti.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Gli oligodendrociti sono le cellule mielinizzanti del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento e la coltura dei loro precursori, le cellule progenitrici degli oligodendrociti, da cortecce di ratto, nonché un metodo quantitativo rapido e affidabile per valutare l'oligodendrogenesi in vitro in risposta a fattori sperimentali.

Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Viene presentato un metodo per la microdissezione dell'ovidotto di topo che consente la raccolta dei singoli segmenti mantenendo l'integrità dell'RNA. Inoltre, viene descritta la procedura di dissociazione delle cellule oviduttali non enzimatiche. I metodi sono appropriati per la successiva analisi genica e proteica dei segmenti oviduttali funzionalmente diversi e delle cellule oviduttali dissociate.

Microdissezione e dissociazione dell'ovidotto murino: identificazione del segmento individuale e isolamento di singole cellule

Il successo della trascrittomica e della multiomica a singola cellula/singolo nucleo dipende in gran parte dalla qualità delle cellule/nuclei. Pertanto, l'isolamento di cellule/nuclei dai tessuti e la loro purificazione devono essere altamente standardizzati. Questo protocollo descrive la preparazione di nuclei dal cervello e dal midollo osseo per il test multioma a singolo nucleo a valle.

Preparazione di nuclei cerebrali e del midollo osseo di alta qualità per saggi multiomi a nucleo singolo

Scopri la dissezione rapida dell'epitelio olfattivo di topo per ottenere sospensioni a nucleo singolo. Questo metodo facilita lo studio del sistema olfattivo mediante sequenziamento RNA a singolo nucleo.

Dissezione rapida e dissociazione dell'epitelio olfattivo di topo per sospensioni a nucleo singolo

Esplora altri video