Tracciamento in vivo guidato da immagini di cellule progenitrici epiteliali polmonari distali trapiantate per la fibrosi polmonare mediante imaging con particelle magnetiche

Questo studio si concentra sul protocollo di intubazione intratracheale come metodo critico di somministrazione per la terapia delle cellule polmonari, con l'obiettivo di ottimizzare il trapianto cellulare e il tracciamento non invasivo utilizzando l'imaging a particelle magnetiche nella fibrosi polmonare. Il nostro protocollo affronta la mancanza di metodi non invasivi per il tracciamento in vivo della terapia cellulare nella fibrosi polmonare combinando isolamento intratracheale con imaging a particelle magnetiche per monitorare la distribuzione cellulare. Il nostro protocollo offre una consegna cellulare localizzata precisa tramite installazione intratracheale e un tracciamento superiore tramite imaging a particelle magnetiche, fornendo un'alta sensibilità e imaging in tempo reale senza rumore di fondo.

Per cominciare, pesa un maschio di 12 settimane di topo NOD o SCID per calcolare la dose richiesta di bleomicina. Prepara la soluzione di bleomicina in soluzione salina sterile alla concentrazione desiderata fino a un volume finale di 50 microlitri in un tubo microcentrifuga da 1,7 millilitri. Poi carica la soluzione in una pipetta.

Precarica una siringa con 200 microlitri d'aria per assicurarti che l'intero volume liquido venga espulso nella trachea durante l'iniezione. Dopo aver anestetizzato il topo, assemblare il kit di intubazione con fibra luminosa con la sonda in fibra ottica infilata attraverso il laringoscopio e il catetere. Pizzica il dito del piede dell'animale per confermare un'anestesia adeguata e applica unguenta oftalmica su entrambi gli occhi ogni volta che l'animale è sotto anestesia.

Sospendere il topo per gli incisivi in posizione supina su un supporto inclinato per l'intubazione dei roditori. Usando pinze smussate, afferra la lingua e spostala delicatamente verso l'alto e verso sinistra per esporre la laringe e una visualizzazione chiara. Accendi la sonda a fibra ottica e guidala nella bocca per avvicinarla alla trachea.

Usa la lente d'ingrandimento del laringoscopio per migliorare la visibilità e identificare le corde vocali all'apertura tracheale. Inserire il catetere nell'apertura tracheale e rimuovere delicatamente il laringoscopio. Poi posiziona una goccia di soluzione salina da 20 microlitri all'estremità superiore del catetere.

Attacca la siringa precaricata con 200 microlitri d'aria e spingi la goccia nella trachea. Successivamente, carica il catetere con fino a 50 microlitri di bleomicina e iniettalo usando la siringa piena d'aria. Tieni il catetere in posizione per 5-7 secondi per evitare il reflusso del liquido dalla trachea.

Poi rimuovi delicatamente il catetere. Tieni il mouse sulla base di intubazione nella stessa posizione per almeno 30 secondi. Poi togli il mouse dal supporto e mettilo in una gabbia di recupero posizionata su una borsa riscaldante.

Monitora il topo continuamente finché non si riprende completamente dall'anestesia. Ottenere cellule epiteliali delle vie aeree umane marcate da nanoparticelle da pazienti con fibrosi polmonare idiopatica. 72 ore dopo l'installazione della bleomicina, si ri-anestesia il topo e si ripete la procedura di installazione intratracheale per somministrare 50.000 cellule in 50 microlitri di sospensione cellulare.

Lascia che il topo si riprenda per almeno 20 minuti prima dell'imaging con particelle magnetiche. Installa il letto del topo nello scanner per immagini magnetiche delle particelle dopo aver fatto passare la linea di anestesia sotto il letto attraverso i connettori corretti. Mentre il topo viene anestetizzato, prepara lo scanner per immagini a particelle magnetiche.

Dopo aver confermato un'anestesia adeguata con un test per pizzicamento del dito dei piedi, posizionare con cura il topo sul letto di immagine a particelle magnetiche. Spingi il piano con il mouse nel foro dello scanner e clicca su Start Scan nell'interfaccia software per avviare l'immagini. Dopo il completamento della scansione, togli il topo dal letto di imaging a particelle magnetiche e mettilo in una gabbia di recupero posizionata su una borsa riscaldante.

Infine, analizza le immagini acquisite utilizzando un software di analisi delle immagini. L'intensità del segnale di immagine a particelle magnetiche 2D o MPI è aumentata proporzionalmente alla concentrazione del tracciante di ossido di ferro su tutti i conteggi cellulari testati. È stata selezionata una concentrazione ottimale di 250 microgrammi per millilitro.

La microscopia a fluorescenza ha confermato il successo della marcatura in vitro delle cellule, mostrando segnali di dextrano rosso nel citoplasma e nuclei colorati di blu DAPI. Le intensità del segnale nelle immagini MPI 2D aumentavano con il numero di cellule marcate, confermando una correlazione positiva tra segnale e conteggio cellulare. Sulla base di ciò, furono selezionate 50.000 cellule per il trapianto.

L'immagine del controllo del letto vuoto non mostrava alcun segnale MPI di sfondo, confermando la specificità dello scanner alle celle etichettate. I quattro segnali osservati corrispondono a marcatori fiduciari usati come controlli. Il trapianto riuscito di cellule marcate nei polmoni ha prodotto un segnale MPI distinto a forma di farfalla con distribuzione visibile in entrambi i polmoni, convalidando una consegna intratracheale efficace.

L'installazione incompleta delle cellule ha portato alla comparsa di segnali sia nei polmoni che nella regione del collo, indicando perdite dovute alla rimozione prematura del catetere. Il posizionamento errato del catetere nell'esofago invece che nella trachea faceva apparire il segnale MPI più basso nell'addome, indicando la deposizione di cellule nello stomaco. 14 giorni dopo il trapianto, l'imaging ex vivo dei polmoni ampiati ha confermato la persistenza delle cellule marcate.

I nostri risultati miglioreranno la precisione diagnostica e permetteranno lo sviluppo di terapie mirate per le malattie polmonari, inclusa la terapia con cellule staminali, accelerando il progresso e l'innovazione nell'imaging polmonare e nei campi biomedici correlati. Il nostro laboratorio si concentrerà sull'integrazione delle terapie a base di cellule staminali per la fibrosi polmonare, migliorando le tecniche di imaging non invasive, mirando al contempo a ottimizzare la somministrazione cellulare e monitorare l'efficacia terapeutica per la fibrosi polmonare.