Un modello di espianto ex vivo per lo studio delle interazioni gliali nella retina del topo

Vogliamo capire la neuroinfiammazione nel glaucoma, la principale causa di cecità irreversibile in tutto il mondo. In particolare, stiamo studiando come le cellule di supporto gliali nella retina influenzano la perdita neuronale durante la progressione della malattia.

Si ritiene che le glia come gli astrociti e le microglia influenzino la progressione del glaucoma, ma molti degli strumenti utilizzati per studiare la funzione neuronale in modelli animali vivi non sono adatti a queste cellule. Gli espianti di retina vengono utilizzati per studiare la neuroinfiammazione e la funzione gliale, ma la curva di apprendimento è ripida. Il nostro protocollo lo rende più accessibile e, si spera, consente una più ampia adozione della tecnica.

Rispetto alla tradizionale coltura cellulare in vitro, il nostro approccio di espiantazione preserva meglio l'ambiente naturale per le cellule della retina interna, consentendo un'indagine più accurata sulle loro funzioni fisiologiche.

[Narratore] Per iniziare, posizionare l'occhio di topo estratto in una capsula di dissezione riempita con PBS sterile a temperatura ambiente. Identificare un punto di tenuta appropriato e afferrarlo con una pinza angolata, quindi posizionare delicatamente l'occhio sulla salvietta da laboratorio sommersa assicurandosi che l'asse antero-posteriore dalla cornea al nervo ottico sia posizionato orizzontalmente. Mantenendo una presa salda con una pinza angolata, utilizzare la punta di un bisturi numero 11 per praticare un'incisione parallela e di circa 0,5 millimetri posteriormente al limbus dove la cornea passa alla sclera. Inserire una lama delle forbici a molla all'interno del globo e tagliare circonlimbamente intorno all'occhio, riposizionandosi secondo necessità con una pinza. Dopo aver completato il taglio circonlimbare, rimuovere il segmento anteriore e la lente con una pinza. Se rimane un lungo pezzo di nervo ottico, taglialo a una lunghezza di uno o due millimetri usando le forbici sottili. Quindi ruotare l'oculare in modo che sia rivolto verso l'alto per consentire l'ispezione visiva e facilitare la rimozione del vitreo. Continua a usare una pinza angolata per immobilizzare la conchiglia oculare e ispezionare la retina per danni visibili ed esaminare la camera vitrea alla ricerca di detriti cellulari pigmentati dall'epitelio pigmentato retinico o dalla coroide. Utilizzando una pipetta di trasferimento modificata, lavare la camera vitreale con PBS, mantenendo il puntale della pipetta sommerso per evitare la formazione di bolle d'aria. Quindi, con un pennello per acquerello fine, rimuovere delicatamente i detriti più grandi riducendo al minimo il contatto con la retina. Per i detriti persistenti, utilizzare con attenzione una pinza a punta fine, evitando il contatto diretto del metallo con la retina. Dopo aver eliminato i detriti visibili, lavare la camera vitreale con PBS dalla pipetta di trasferimento da tre a cinque volte e utilizzare la spazzola fine per sondare vicino alla periferia gli elementi residui del corpo ciliare, rilevando il vitreo dal trascinamento sulle fibre della spazzola. Se rimangono sacche di vitreo, spazzare verso l'esterno verso la periferia con lo spazzolino, mantenendo le fibre a un angolo ridotto per prevenire danni alla retina. Tenere un paio di pinze in posizione chiusa con le punte a contatto e inserirle delicatamente tra la retina e la coroide utilizzando eventuali fessure naturali formate durante la manipolazione. Utilizzare le braccia piatte del forcipe per allargare gradualmente lo spazio tra la retina e la coroide fino a raggiungere la completa separazione. Continuare a stabilizzare il campione con un paio di pinze mentre si utilizza un secondo paio per tirare delicatamente la conchiglia oculare, compresa la sclera e la coroide, verso il basso. Se la retina scende con l'oculare, utilizzare la pinza per sondare delicatamente e staccare eventuali punti di connessione rimanenti, evitando la testa del nervo ottico. Quindi, con la retina ancora ancorata alla testa del nervo ottico, continua a tenere fermo il tessuto e usa il secondo paio di pinze per raggruppare la conchiglia oculare sotto la testa del nervo ottico. Ispezionare per confermare che la periferia retinica non sia ripiegata a causa del vitreo residuo, in particolare nei siti in cui rimane il corpo ciliare. Se necessario, lavare la camera con PBS utilizzando una pipetta di trasferimento e utilizzare lo spazzolino per srotolare delicatamente la retina piegata e rimuovere il vitreo in eccesso. Dopo che la retina è stata esposta da entrambi i lati, utilizzare le forbici a molla per eseguire una serie di tagli di sollievo a circa 90 gradi di distanza dalla periferia retinica verso la testa del nervo ottico. Tenendo il tessuto sommerso, utilizzare una pinza per estrarre lateralmente la salvietta da laboratorio dal campione e rimuoverla dal piatto senza toccare la retina. Tenendo la retina in posizione, usa le forbici a molla per recidere il nervo ottico appena sotto la retina. Quindi sollevare con cautela e rimuovere il fazzoletto della conchiglia oculare rimanente dal piatto. Ora riempi una piastra di Petri da 35 millimetri con PBS e usa una pinza per posizionare un quadrato del filtro sul fondo con il lato ruvido e opaco rivolto verso l'alto, evitando pieghe. Quindi, utilizzando la pipetta di trasferimento, aspirare delicatamente la retina e trasferirla nella piastra di Petri. Utilizzare lo spazzolino per orientare la retina con la superficie interna rivolta verso l'alto e posizionarla direttamente sopra la squadra del filtro. Aspirare lentamente il PBS per abbassare la retina sul filtro. Una volta che la retina è posizionata sul filtro, utilizzare lo spazzolino per srotolare delicatamente eventuali pieghe periferiche. Regolare il livello di PBS per bilanciare la stabilità e l'idratazione della retina, consentendo un movimento fluido della spazzola senza seccare il tessuto. Ora usa la pipetta di trasferimento per gocciolare il PBS da circa un centimetro di altezza per risciacquare la superficie e ispezionare nuovamente la retina alla ricerca di detriti. Chiudere il coperchio del piatto da 35 millimetri e portarlo nella camera di biosicurezza. Posizionare la capsula chiusa all'interno della cabina di biosicurezza senza entrare in contatto con le superfici interne o le attrezzature. Sterilizzare o sostituire i guanti quando si passa al lavoro asettico e trasferire la piastra a sei pozzetti precaricata con il terreno di espianto dall'incubatore alla cappa di biosicurezza. All'interno dell'armadio, rimuovere il coperchio del piatto da 35 millimetri e utilizzare una pinza angolata per sollevare il quadrato del filtro senza toccare la retina. Quindi aprire la piastra a sei pozzetti e abbassare delicatamente il filtro al centro dell'inserto in un pozzetto, immergendolo lentamente nel supporto. Una volta che la retina si è separata dal filtro, sposta lentamente il filtro da parte e rimuovilo dal pozzetto usando una pinza angolata. Utilizzare una pipetta da un millilitro per aspirare 500 microlitri di terreno dall'inserto, intrappolando la retina tra l'inserto e l'interfaccia aria-liquido. Infine, riposizionare il coperchio sulla piastra a sei pozzetti e rimetterla nell'incubatrice, assicurandosi che la retina rimanga centrata all'interno del pozzetto. Per esaminare i cambiamenti su larga scala nella glia retinica, le retine espiantate per tre giorni sono state confrontate con espianti fittizi fissati immediatamente dopo l'isolamento invece di essere coltivate. Le microglia nelle retine fittizie hanno mostrato un modello di distribuzione regolare e non sovrapposto, mentre dal terzo giorno l'organizzazione delle retine espiantate è diventata irregolare con cellule che apparivano raggruppate, implicando la migrazione. Gli astrociti retinici nelle retine fittizie mostravano uno stretto allineamento con il sistema vascolare, che diminuiva significativamente dopo tre giorni in vitro. L'espressione di GFAP nelle cellule di Mueller era debole o assente nelle retine fittizie, ma è diventata distintamente visibile entro il terzo giorno in vitro, specialmente vicino ai bordi dei tessuti. Dopo un giorno in vitro, la microglia ha mostrato una retrazione del processo e segni precoci di attivazione che sono progrediti fino a una morfologia ameboide compatta entro il terzo giorno. Al traguardo delle 24 ore, la densità delle cellule gangliari retiniche quantificata utilizzando Brn3a ha mostrato un modesto ma marcato declino degli espianti di coltura rispetto a quelli fittizi. TMEM119, un marcatore microgliale omeostatico, era altamente espresso nelle retine fittizie, ma era quasi non rilevabile dopo tre giorni in vitro. L'espressione di CD206, che marcava gli ialociti, è rimasta stabile dopo tre giorni di coltura in vitro. La colorazione GFAP ha rivelato la reattività degli astrociti e delle cellule di Mueller intorno ai siti di lesioni meccaniche subite durante la dissezione e la manipolazione.