Etichettatura hESC e hMSCs con nanoparticelle di ossido di ferro per i non-invasiva in vivo inseguimento con la RM

Per la valutazione delle terapie con cellule staminali nuovo, è importante non invasiva traccia le cellule iniettate in vivo. Questo video vi mostrerà come etichetta cellule staminali mesenchimali ed embrionali con il ferro mezzi di contrasto a base di ossidi in vivo per la successiva RM in vivo.

Benvenuti nel laboratorio del Dr.Haiku Dal Link. Ringraziamo il California Institute of Regenerative Medicine per aver finanziato questo progetto per la valutazione di nuove terapie con cellule staminali. È importante tracciare in modo non invasivo le cellule iniettate in vivo.

Ciò è possibile marcando le cellule in vitro con agenti di contrasto specifici o multifunzionali per l'imaging RM o l'imaging ottico. Questo video vi mostrerà come marcare le cellule staminali mesenchimali umane e embrionali umane per il successivo imaging in vivo. Ciao, sono Tobias Henning del Contrast Agent Research Group presso il Center for Molecular and Functional Imaging del Dipartimento di Radiologia dell'Università della California di San Francisco.

Oggi vi mostrerò le procedure per la marcatura in vitro di cellule staminali mesenchimali umane con cellule staminali periche, carone e di cellule staminali embrionali umane con ossidi phem. Questa tecnica è utile per localizzare le cellule iniettate in vivo o per ottenere informazioni sul loro stato funzionale. Le procedure per la marcatura cellulare con agente cosciente alla risonanza magnetica variano per le cellule staminali embrionali e mesenchimali, ma entrambe le tecniche prevedono i seguenti passaggi, preparazione della coltura cellulare che è la placcatura delle cellule come aderire alle colture cellulari, preparazione della marcatura, marcatura dei terreni delle cellule mediante semplice incubazione tripsina delle cellule staminali e lavaggio con l'agente cosciente libero, valutazione dell'efficienza della marcatura e della vitalità cellulare.

Quindi iniziamo a etichettare alcune celle. Ora iniziamo con l'etichettatura delle cellule staminali mesenchimali con Theo Carbatrol. In primo luogo, mostrerò la tecnica per marcare le cellule staminali mesenchimali umane con l'agente di contrasto a base di theo carron e ossido di ferro per l'imaging RM.

Per iniziare, impiattiamo le cellule da 18 a 24 ore prima della procedura di marcatura in fiasche T 75 a una confluenza dell'80%Altrimenti, se si utilizza un piatto di coltura diverso che equivale a circa 10.000 cellule per centimetro quadrato il giorno successivo, iniziamo con la preparazione dei terreni di marcatura aggiungendo 30 microlitri di riservista a otto millilitri di terreno privo di siero. Questo etichetterà un T 75 FLA con una cofluenza dell'80% e corrisponde a una concentrazione di cento microgrammi di ferro per millilitro di terreno. Ora togliamo i terreni di coltura e laviamo le cellule una volta con PBS o terreni privi di siero.

Lo facciamo per eliminare le proteine sieriche residue e altri costituenti del terreno che potrebbero legare gli agenti di contrasto e influenzare l'efficienza della marcatura. Aggiungere il mezzo di etichettatura al pallone e rimettere il pallone nell'incubatrice. Dopo due ore, aggiungere due ml di FCS in modo da raggiungere una concentrazione finale del 20% di FCS.

Lo facciamo per garantire che le cellule non ricevano alcuno stimolo per differenziare che sono morte nel loro ambiente familiare. Ora incubiamo le cellule per 18 ore. Il giorno successivo sciacquiamo le cellule con PBS e poi le personalizziamo secondo i protocolli di coltura standard per eliminare il mezzo di contrasto libero.

Una volta inizzato il Tryps, la sospensione cellulare viene lavata tre volte centrifugando a 400 RCF per cinque minuti e sospendendo il reus in PBS. Questo è tutto. La cella finale P può essere risospesa ed è pronta per ulteriori esperimenti.

Contiamo ora le celle perché potremmo averne perse alcune durante le precedenti fasi di lavaggio. A questo punto eseguiamo anche test di vitalità utilizzando il saggio di esclusione del blu trippin e preleviamo alcuni campioni per l'analisi spettrometrica per misurare l'efficienza della marcatura. Ora lasciate che vi mostri come etichettare le cellule staminali embrionali umane con ossidi phem.

Per iniziare, impiattiamo le cellule staminali embrionali umane in piatti di 10 centimetri. Come al solito, queste piastre sono precodificate con gelatina e hanno cellule di alimentazione irradiate su di esse. È possibile utilizzare questo protocollo anche per le colture prive di alimentatore.

Lasciamo che le cellule staminali embrionali umane si attacchino e crescano per circa tre o quattro giorni in modo che formino colonie di medie dimensioni. Durante questo periodo, ci assicuriamo che le colonie non diventino troppo grandi perché le colonie più grandi sono più difficili da rompere. Successivamente, le cellule differenziate possono contaminare queste colture.

Quindi, a seconda della pulizia delle colonie, potremmo doverci sbarazzare delle colture differenziate mediante dissezione. Ora prepariamo il terreno di marcatura che consiste in ossidi del teorema a una concentrazione di cento microgrammi di ferro per millilitro e mezzi di cellule staminali embrionali umane complete. Per questo, mescoliamo 89 microlitri, ossidi phem e 10 millilitri di terreno di coltura completo.

Per quanto riguarda le cellule staminali mesenchimali, laviamo il piatto una volta con un terreno completo per eliminare le cellule morte o i detriti. Quindi aggiungiamo 10 millilitri di terreno di etichettatura per piatto e incubiamo le cellule per quattro ore. Ora l'etichettatura è completa.

Nella fase successiva, dobbiamo lavare le celle e ottenere una sospensione a cellula singola. Per un ulteriore utilizzo Per questo, sciacquiamo prima il piatto con PBS. Sostituiamo ora il PBS con cinque millilitri di tripsina allo 0,25% e incubiamo per cinque minuti nell'incubatore o fino a quando le cellule non si staccano.

Aiuta a picchiettare frequentemente il piatto, le cellule si sono ormai staccate. Tieni presente che se il piatto conteneva colonie più grandi, potrebbero essere rimasti alcuni ciuffi per sbarazzarsi di questi grumi. Mescoliamo accuratamente l'intera sospensione pipettando su e giù, utilizzando una pipetta sierologica, e poi la lasciamo riposare per altri due minuti.

Nella tripsina. Non utilizziamo una pipetta eppendorf poiché il pipettaggio ripetuto delle cellule attraverso la punta sottile può rompere le membrane cellulari se tutto funziona correttamente. Ora abbiamo una sospensione a singola cellula che viene mescolata con molti detriti provenienti dalla gelatina che riveste la matrice delle cellule staminali embrionali e le cellule morte.

Ora possiamo sbarazzarci dei grumi o dei complessi rimanenti facendo passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri. Ora dobbiamo isolare le cellule staminali embrionali umane dalle cellule nutritrici irradiate. Questo può essere fatto in modo efficiente placcando la sospensione cellulare su un piatto rivestito di gelatina.

Se non manipoliamo la capsula, tutte le cellule si sedimenteranno, ma gli alimentatori si attaccheranno più velocemente delle cellule staminali embrionali umane. Quindi, se togliamo il natina SUP dopo 45 minuti, dovrebbe contenere principalmente cellule staminali embrionali umane, mentre le mangiatoie dovrebbero essere principalmente attaccate al piatto. In questo modo, otteniamo una sospensione di cellule staminali embrionali umane marcate magneticamente che possono essere utilizzate per ulteriori esperimenti come nel protocollo precedente.

A questo punto, è necessario contare le celle e prelevare campioni per la valutazione della fattibilità e la misurazione dell'efficienza dell'etichettatura. Quindi questo conclude i protocolli che volevo mostrarvi oggi. Ora diamo un'occhiata a come possiamo tracciare le cellule staminali marcate in vivo.

Questa diapositiva mostra le cellule staminali marcate con OC Carone. Dopo che sono stati iniettati nel cervello di un topo, abbiamo sospeso 20.000 cellule del volume di 75 nanolitri e le abbiamo iniettate nella zona subventricolare. L'ossido di ferro nelle cellule impiantate provoca un artefatto di suscettibilità che può essere visto sulla risonanza magnetica. Immagini.

Ti abbiamo appena mostrato come marcare le cellule staminali embrionali e mesenchimali. In vitro con gli agenti Mr.Contrast che tracciano le cellule staminali mesenchimali ed embrionali in vivo ha un enorme potenziale per la valutazione di nuove terapie con cellule staminali. Quindi questo è tutto.

Grazie per l'attenzione e buona fortuna con l'etichettatura delle celle.