Etichettatura hESC e hMSCs con nanoparticelle di ossido di ferro per i non-invasiva in vivo inseguimento con la RM

Benvenuti nel laboratorio del Dott. Haiku Dal Link. Desideriamo ringraziare l'Istituto della California per la Medicina Rigenerativa per il finanziamento di questo progetto volto alla valutazione di nuove terapie con cellule staminali. È fondamentale monitorare in modo non invasivo le cellule iniettate in vivo.

Questo è possibile etichettando le cellule in vitro con agenti di contrasto specifici o multifunzionali per l'imaging mediante risonanza magnetica o l'imaging ottico. Questo video ti mostrerà come etichettare cellule staminali mesenchimali umane e cellule staminali embrionali umane per successivi esami di imaging in vivo. Ciao, sono Tobias Henning del gruppo di ricerca sugli agenti di contrasto presso il Centro per l'Imaging Molecolare e Funzionale del Dipartimento di Radiologia dell'Università della California di San Francisco.

Oggi vi mostrerò le procedure per l'etichettatura in vitro di cellule staminali mesenchimali umane con peric, carone e di cellule staminali embrionali umane con ossidi di ferro. Questa tecnica è utile per localizzare le cellule iniettate in vivo o per ottenere informazioni sul loro stato funzionale. Le procedure per l'etichettatura cellulare con agenti di contrasto per risonanza magnetica variano a seconda che si tratti di cellule staminali embrionali o mesenchimali, ma entrambe le tecniche prevedono i seguenti passaggi: preparazione della coltura cellulare, ovvero il seeding delle cellule aderenti; preparazione del mezzo di etichettatura; etichettatura delle cellule mediante semplice incubazione; tripsinizzazione delle cellule staminali; rimozione dell'agente di contrasto non legato mediante lavaggio; valutazione dell'efficienza di etichettatura e della vitalità cellulare.

Iniziamo dunque a etichettare alcune cellule. Cominciamo con l'etichettatura delle cellule staminali mesenchimali mediante Theo Carbatrol. Di seguito illustrerò la tecnica per etichettare le cellule staminali mesenchimali umane con theo carron e un agente di contrasto a base di ossido di ferro per la risonanza magnetica.

Per iniziare, si seminano le cellule da 18 a 24 ore prima della procedura di marcatura in fiaschi T75 a una confluenza dell'80%. In alternativa, se si utilizza una piastra per colture diversa corrispondente a circa 10.000 cellule per centimetro quadrato il giorno successivo, si inizia preparando il mezzo di marcatura aggiungendo 30 microlitri di Reservist a otto millilitri di mezzo privo di siero. Questo permette di marcare un fiasco T75 a una confluenza dell'80% e corrisponde a una concentrazione di cento microgrammi di ferro per millilitro di mezzo. A questo punto, si asporta il mezzo di coltura e si lavano le cellule una volta con PBS o con mezzo privo di siero.

Questo passaggio serve ad eliminare le proteine sieriche residue e altri componenti del mezzo che potrebbero legare gli agenti di contrasto e influenzare l'efficienza della marcatura. Aggiungere il mezzo di marcatura al flask e reinserire il flask nell'incubatore. Dopo due ore, aggiungere due ml di FCS in modo da ottenere una concentrazione finale del 20% di FCS.

Questo passaggio garantisce che le cellule non ricevano alcuno stimolo di differenziazione e possano crescere nel loro ambiente familiare. Ora incubiamo le cellule per 18 ore. Il giorno successivo laviamo le cellule con PBS e quindi le trattiamo secondo i protocolli standard di coltura al fine di eliminare l'agente di contrasto libero.

Dopo la tripsinizzazione, la sospensione cellulare viene lavata tre volte mediante centrifugazione a 400 RCF per cinque minuti e risospesa in PBS. È tutto. L'ultimo pellet cellulare può essere risospeso ed è pronto per ulteriori esperimenti.

Ora contiamo le cellule poiché potremmo averne perse alcune durante i precedenti passaggi di lavaggio. Inoltre, eseguiamo in questo momento il test di vitalità utilizzando il saggio di esclusione del trippin blu e preleviamo alcuni campioni per l'analisi spettrometrica al fine di misurare l'efficienza di marcatura. Ora vi mostrerò come marcare le cellule staminali embrionali umane con gli ossidi di phem.

Per iniziare, si seminano le cellule staminali embrionali umane in piastre da 10 centimetri. Come di consueto, queste piastre sono pre-trattate con gelatina e contengono cellule di supporto irradiate. È possibile utilizzare questo protocollo anche per colture senza cellule di supporto.

Lasciamo attaccare e crescere le cellule staminali embrionali umane per circa tre o quattro giorni, in modo che formino colonie di dimensioni medie. Durante questo periodo, ci assicuriamo che le colonie non crescano troppo, poiché le colonie più grandi sono più difficili da frammentare. In seguito, cellule differenziate potrebbero contaminare queste colture.

Pertanto, a seconda della purezza delle colonie, potremmo dover eliminare le colture differenziate mediante dissezione. Ora prepariamo il mezzo di marcatura, costituito da ossidi di theorem a una concentrazione di cento microgrammi di ferro per millilitro e da mezzo completo per cellule staminali embrionali umane. A tale scopo, mescoliamo 89 microlitri di ossidi di phem e 10 millilitri di mezzo di crescita completo.

Per quanto riguarda le cellule staminali mesenchimali, laviamo la piastra una volta con il mezzo completo per rimuovere le cellule morte o i detriti. Successivamente aggiungiamo 10 millilitri di mezzo di marcatura per piastra e incubiamo le cellule per quattro ore. A questo punto la marcatura è completa.

Nel passaggio successivo, dobbiamo lavare le cellule e ottenere una sospensione di singole cellule. A questo scopo, laviamo innanzitutto la piastra con PBS. Sostituiamo ora il PBS con cinque millilitri di tripsina 0,25% e incubiamo per cinque minuti nell'incubatore o fino al distacco delle cellule.

È utile battere delicatamente sulla piastra frequentemente finché le cellule si sono staccate. Tener presente che, se la piastra conteneva colonie più grandi, potrebbero rimanere alcuni grumi; per eliminarli, si mescola accuratamente l'intera sospensione aspirando e dispensando più volte con una pipetta serologica, quindi si lascia riposare per altri due minuti.

Nel tripsina. Non utilizziamo una pipetta eppendorf poiché il pipettaggio ripetuto delle cellule attraverso la punta sottile può rompere le membrane cellulari se tutto ha funzionato correttamente. Ora abbiamo una sospensione di singole cellule mescolata con molti detriti provenienti dal rivestimento di gelatina della matrice di cellule staminali embrionali e da cellule morte.

Ora possiamo eliminare gli aggregati o complessi rimanenti facendo passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri. Ora dobbiamo isolare le cellule staminali embrionali umane dalle cellule di supporto irradiate. Questo può essere fatto in modo efficiente piastrando la sospensione cellulare su una piastra rivestita con gelatina.

Se non manipoliamo la piastra, tutte le cellule sedimentano verso il basso, ma le cellule nutrici si attaccano più rapidamente rispetto alle cellule staminali embrionali umane. Pertanto, se rimuoviamo il sopranatante dopo 45 minuti, questo dovrebbe contenere principalmente cellule staminali embrionali umane, mentre le cellule nutrici dovrebbero essere per lo più attaccate alla piastra. In questo modo, otteniamo una sospensione di cellule singole di cellule staminali embrionali umane marcate magneticamente che può essere utilizzata per ulteriori esperimenti, come nel protocollo precedente.

A questo punto, è necessario contare le cellule e prelevare campioni per la valutazione della vitalità e della misurazione dell'efficienza di marcatura. In questo modo si completano i protocolli che desideravo mostrarvi oggi. Ora diamo un'occhiata a come possiamo tracciare le cellule staminali marcate in vivo.

Questa diapositiva mostra cellule staminali etichettate con OC Carone. Dopo essere state iniettate nel cervello di un topo, abbiamo risospeso 20.000 cellule in un volume di 75 nanolitri e le abbiamo iniettate nella zona subventricolare. L'ossido di ferro presente nelle cellule impiantate provoca un artefatto di suscettibilità visibile nelle immagini di risonanza magnetica.

Abbiamo appena mostrato come etichettare cellule staminali embrionali e mesenchimali. L'uso di agenti di contrasto per il tracciamento in vitro e in vivo delle cellule staminali mesenchimali ed embrionali ha un potenziale enorme nella valutazione di nuove terapie basate su cellule staminali. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con la vostra etichettatura cellulare.