Analisi comportamentale della disfunzione locomotoria in Drosophila melanogaster come lettura della neurotossicità

L'obiettivo della nostra ricerca è quello di sviluppare un metodo economicamente vantaggioso ed etico per lo screening dei composti neurotossici. I metodi tradizionali di test tossicologici spesso si basano su modelli di tariffa virtuali, che sono costosi, richiedono tempo, altrimenti preoccupazioni etiche come sappiamo. Volevamo esplorare se potevamo rilevare i primi segni di neurotossicità utilizzando un modello alternativo come una Drosophila melanogaster che è sia sensibile che scalabile. Questo protocollo ci aiuta a rilevare fenotipi comportamentali come alterazioni dei modelli di movimento e iperattività, ma anche declino motorio progressivo o interruzioni scritte della sicurezza, e viene anche testata l'ampia preferenza.

Ciò che rende il nostro protocollo vantaggioso è che combina il classico test rampicante con una tecnologia di monitoraggio in tempo reale, e questo ci consente di catturare sottili menomazioni motorie che potrebbero essere perse. Con metodi tradizionali che forniscono una maggiore sensibilità e dati comportamentali più precisi.

[Narratore] Per iniziare, trasferisci delicatamente le mosche in una bottiglia vuota. Metti la bottiglia contenente le mosche all'interno di una scatola piena di ghiaccio, assicurandoti che l'intera bottiglia sia coperta. Dopo un minuto, picchiettare delicatamente la bottiglia per verificare che tutte le mosche siano anestetizzate. Prepara un contenitore più piccolo pieno di ghiaccio. Posiziona una capsula di Petri o una superficie piana e pulita sopra il ghiaccio per creare una piattaforma fredda. Ora capovolgi il tubo sulla capsula di Petri raffreddata e picchietta delicatamente per rilasciare le mosche sulla superficie fredda. Trasferire con cura le mosche in fiale vuote. Lasciare che le mosche si riprendano dall'anestesia per 30 minuti in un ambiente controllato a 25 gradi Celsius con un ciclo di luce-buio di 12 ore e un'umidità del 50%. Successivamente, per la preparazione del mangime microcapillare, utilizzare una pipetta per caricare manualmente 10 microlitri della soluzione di prova in ciascuna provetta microcapillare, garantendo un volume costante in tutti i campioni. Aggiungere da tre a cinque microlitri di olio minerale all'estremità aperta di ciascun tubo microcapillare per evitare evaporazioni e perdite durante l'esperimento. Inserire i microcapillari preriempiti attraverso i fori dei tappi delle fiale di cotone, garantendo una vestibilità sicura. Metti le fiale contenenti mosche in un'incubatrice impostata a 25 gradi Celsius con un ciclo di luce-buio di 12 ore e lascia le fiale nell'incubatrice per tutta la durata dell'esperimento. Ogni 12 ore, trasferire le mosche in una fiala pulita e vuota per valutare la loro attività locomotoria. Misurare e segnare la linea a sette centimetri dal fondo della fiala utilizzando un pennarello indelebile. Questo segno servirà come bersaglio per l'arrampicata. Posiziona una fotocamera o un telefono in una posizione stabile per registrare il comportamento di arrampicata. Garantisci un'illuminazione adeguata e uno sfondo trasparente per consentire una chiara visibilità e analisi. Verificare che la configurazione sperimentale sia compatibile con il campo visivo della fotocamera e avviare la registrazione. Rivedi le registrazioni video e misura il tempo impiegato da ogni mosca per raggiungere i sette centimetri. Preparare i microcapillari di alimentazione con il campione e il sigillo di olio minerale come mostrato in precedenza. Quindi preparare le singole camere di locomozione utilizzando cannucce di plastica trasparente tagliate a circa sei centimetri di lunghezza. Sigillare un'estremità di ogni cannuccia con una pellicola trasparente per creare una chiusura ermetica. Vicino all'estremità sigillata della cannuccia, creare un piccolo foro per inserire il microcapillare di alimentazione, assicurandosi che aderisca perfettamente e non perda o si muova durante il test. Dopo aver anestetizzato e segregato i moscerini come mostrato in precedenza, posizionare delicatamente un moschetto anestetizzato in ciascun tubo utilizzando un pennello fine. Sigillare l'estremità aperta di ciascun tubo con una pellicola trasparente o un tappo di cotone, consentendo il flusso d'aria e impedendo la fuoriuscita. Inserire ora un microcapillare preriempito in ogni camera preparata attraverso l'apposito foro. Posizionare le provette assemblate nell'arena del test, assicurandosi che i microcapillari rimangano accessibili per la sostituzione quotidiana. Posizionare l'intera configurazione all'interno di una camera mantenuta a 25 gradi Celsius con un ciclo di buio chiaro di 12 ore e un'umidità del 50%. Collegare il dispositivo al sistema di localizzazione o alla rete locale. Accedi alla piattaforma software e individua il dispositivo assegnato all'esperimento. Assicurati che il sistema stia tracciando correttamente ogni mosca in base ai marcatori visivi. Inserisci tutti i metadati sperimentali e inizia a registrare il saggio. La capacità di arrampicata valutata utilizzando il test di geotassi negativa a 24 e 48 ore mostra prestazioni simili tra i gruppi di controllo e di trattamento a 24 ore, indicando che non ci sono deficit motori immediati. Entro 48 ore, i moscerini trattati impiegano quasi il doppio del tempo per arrampicarsi rispetto ai controlli, riflettendo una significativa compromissione motoria. Il monitoraggio continuo dell'attività rivela che i moscerini trattati mostrano inizialmente un movimento intensificato, ma la loro attività diminuisce bruscamente dopo 12 ore, suggerendo un'ipereccitabilità precoce seguita da una ridotta funzione motoria. Da 24 a 40 ore, i moscerini trattati mostrano un movimento ridotto rispetto ai controlli. Nel complesso, i moscerini trattati hanno un'attività ridotta di circa il 20% in 40 ore. I moscerini trattati hanno inizialmente risposto con un ritardo ai segnali luminosi seguiti da un allineamento circadiano transitorio, ma hanno progressivamente perso la ritmicità entro 48 ore, probabilmente a causa del deficit locomotore. Le mosche trattate preferiscono le zone di luce più che i controlli.