Rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR ^{iperpolarizzata a 13}C

Abbiamo sviluppato un metodo non invasivo per misurare il metabolismo sierico in tempo reale utilizzando tecniche avanzate di risonanza magnetica magnetica iperpolarizzata. Il nostro obiettivo è creare strumenti accessibili per varie applicazioni di ricerca biologica. Sono stati riportati diversi sistemi NMR iperpolarizzati per il metabolismo sierico. Tuttavia, fino ad ora non erano disponibili protocolli standardizzati e riproducibili per un'implementazione più ampia della ricerca.

Il nostro protocollo migliora l'accessibilità utilizzando i componenti disponibili in commercio. Forniamo anche una convalida completa, inclusi i vantaggi della miscelazione del sistema e le capacità di misurazione ripetuta per un adattamento più ampio. I nostri risultati consentono il monitoraggio in tempo reale dei cambiamenti metabolici dinamici nelle cellule viventi senza distrazioni. Ciò apre nuove possibilità per studi farmacologici a lungo termine in diverse applicazioni di sonde metaboliche.

Il nostro approccio ha dei limiti, tra cui le opzioni prob e i requisiti di automazione. La risoluzione delle sfide stabilirà tecniche di misurazione metabolica cellulare e arricchirà gli sforzi di ricerca DNP del nostro laboratorio in futuro.

[Narratore] Per iniziare, aggiungi due millilitri di soluzione di tripsina EDTA allo 0,25% da volume a volume in un piatto da 10 centimetri. Inclinare delicatamente il piatto per assicurarsi che l'intera superficie sia coperta. Quindi aspirare la soluzione di acido etilendiamminotetracetico in eccesso di tripsina. Mettere il piatto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e incubare per due minuti. Quindi aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura al piatto. Usando una pipetta, pipettare delicatamente su e giù per staccare le cellule dalla superficie e raccogliere l'intera sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri. Ora prendi circa 10 microlitri della sospensione cellulare e caricala in un contatore di celle per determinare il numero di cellule. Assicurarsi che il conteggio misurato confermi una resa di circa 10 milioni di celle o regolare secondo necessità. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 120 x g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare risultante in quattro millilitri di soluzione di alginato al 2% peso/volume e pipettare lentamente per ridurre al minimo la formazione di bolle. Ora aggiungere 10 millilitri di soluzione di cloruro di calcio da 50 millimolari a una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Fissare la siringa al tappo della provetta da centrifuga contenente la soluzione di cloruro di calcio. Aspirare 300 microlitri della miscela di alginato cellulare in una siringa da 0,5 millilitri dotata di un ago da 10 millimetri a tre gauge. Quindi chiudere bene la provetta da centrifuga con la siringa fissata al tappo e posizionare il gruppo nella centrifuga per centrifugare delicatamente a 200 x g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione e risospendere il gel risultante nel terreno di coltura. Successivamente, utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire il gel incapsulato in una provetta NMR e inserire il dispositivo di spugna per garantire una tenuta ermetica. Preriscaldare il serbatoio del mezzo contenente il 5% di ossido di deuterio da volume a volume in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Iniziare la circolazione a una velocità di circa 500 microlitri all'ora per stabilizzare le condizioni. Ispezionare la configurazione per assicurarsi che non vi siano perdite prima di procedere. Aggiungere 18 microlitri di acido piruvico marcato con carbonio 13 a una concentrazione di 14,2 molari drogati con 25 millimolari OX063 a un flaconcino di campione. Collegare la fiala al percorso del fluido del sistema polarizzatore a polarizzazione nucleare dinamica. Quindi, inserire la fiala collegata nell'unità di alesaggio del polarizzatore nucleare dinamico. Applicare l'irradiazione a microonde a circa 188 gigahertz con una potenza di 22 milliwatt per una durata da 60 a 80 minuti. Utilizzare lo spettrometro a risonanza magnetica nucleare a stato solido integrato nel sistema di polarizzazione nucleare dinamica per monitorare l'intensità del segnale al carbonio-13. Registra i dati del segnale ogni cinque minuti utilizzando il software di controllo del sistema. Ora sciogliere rapidamente il campione polarizzato in 3,2 millilitri di tampone di dissoluzione preriscaldato alla temperatura biologica. Caricare il campione preparato in una provetta NMR e inserire la provetta nello spettrometro. Sulla console NMR, avviare la procedura automatizzata per eseguire il blocco, la sintonizzazione, l'abbinamento e lo spessoramento con il campione in posizione per garantire una risoluzione spettrale e una stabilità del segnale ottimali. Caricare una sequenza di acquisizione dell'impulso al carbonio 13 con il disaccoppiamento protonico abilitato utilizzando un'impostazione come 13-CPD. Impostare l'angolo di inversione a 90 gradi con un impulso di un microsecondo etichettato come P1. Successivamente, definisci il tempo di acquisizione come 1,376 secondi, l'ampiezza spettrale come 23.663 hertz e i punti di acquisizione, o TD, come 65.536. Impostare il ritardo di rilassamento D1 su zero secondi. Assegnare 150 incrementi di tempo a TD1 per acquisire 150 spettri sequenziali in modalità pseudo-2 dimensionale e regolare il guadagno del ricevitore su un valore basso, ad esempio circa uno, per evitare la saturazione del segnale causata dai campioni iperpolarizzati. Arrestare ora la pompa peristaltica per arrestare temporaneamente la circolazione del fluido prima di iniettare la soluzione iperpolarizzata attraverso il tubo di ingresso. Iniziare l'acquisizione spettrale circa 10 secondi prima di sciogliere il substrato iperpolarizzato per garantire l'acquisizione del segnale all'arrivo al sito di rilevamento. Quando la soluzione esce dal polarizzatore dinamico a polarizzazione nucleare, aspirarne un millilitro in una siringa. Portare la valvola a tre vie all'ingresso del bioreattore in posizione B per dirigere la soluzione iperpolarizzata nel tubo NMR. Al termine dell'iniezione, riportare la valvola in posizione A per riprendere la circolazione del fluido ed evitare qualsiasi riflusso. Infine, confermare che l'iniezione è andata a buon fine dopo aver notato un aumento del segnale di decadimento dell'induzione libera sul software di acquisizione. Assicurarsi che la soluzione finale raggiunga una temperatura compresa tra 308 e 313 Kelvin e un pH di circa sette prima di trasferirla per la misurazione NMR. Gli spettri NMR al carbonio 13 iperpolarizzato dello stesso campione incapsulato in cella SCCVII sono stati acquisiti a intervalli di 1,5 ore per valutare la fattibilità di misure ripetute non distruttive. La prima misurazione NMR ha mostrato un marcato aumento del segnale del lattato, indicando la conversione metabolica attiva da piruvato a lattato. Misurazioni successive a intervalli di 1,5 ore hanno rivelato una progressiva riduzione dell'intensità del segnale del lattato, indicando una diminuzione dell'attività metabolica nel tempo. Nelle cellule HeLa, le misurazioni iniziali hanno confermato il successo della conversione da piruvato a lattato con picchi di segnale chiaramente distinguibili. Sebbene il segnale sia diminuito gradualmente a causa del rilassamento del T2, il rapporto segnale/rumore è rimasto adeguato per tutta l'acquisizione di 60 secondi, suggerendo che l'attuale protocollo è ampiamente applicabile e può fungere da strumento versatile per la profilazione metabolica in tempo reale in vari tipi di cellule.