Name: Rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR iperpolarizzata a 13C (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Scopri il rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR iperpolarizzata a 13C. Questo metodo non invasivo utilizza un bioreattore personalizzato per tracciare il metabolismo del piruvato con alta riproducibilità.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>acido piruvico [1-13C]</td><td>Cambridge Isot ope Laboratories, Inc.</td><td>CLM-8077</td><td></td></tr><tr><td>Stampante 3D</td><td>Elegoo</td><td>Saturno 2</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06729-55</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Kit di circolazione esterna per pompa</td><td>COME UNO</td><td>1-4141-02</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Set di raccordi senza flangia</td><td>Scienze GL Inc.</td><td>6010-46390</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro con nucleo</td><td>Narishige</td><td>GDC-1.5</td><td>Diametro interno ~0,9 mm, lunghezza 90 mm</td></tr><tr><td>Pompa di circolazione magnetica</td><td>COME UNO</td><td>1-4141-01</td><td></td></tr><tr><td>MestReNova</td><td>Ricerca Mestrelab</td><td></td><td>Software per l'elaborazione e l'analisi spettrale NMR</td></tr><tr><td>La mia siringa</td><td>Nipro Corporation</td><td>8277</td><td>0,5 mL/100U, 30G x 10 mm, 140 pz</td></tr><tr><td>OX063</td><td>&nbsp; Strumenti di Oxford Co. Ltd. e Polarize IVS Co. Ltd.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in PEEK</td><td>COME UNO</td><td>3-780-05</td><td></td></tr><tr><td>penicillina-streptomicina</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>26252-94</td><td></td></tr><tr><td>Mini pompa peristaltica Bio</td><td>ATTO</td><td>1221200</td><td>Alta precisione, tipo ad ampia portata per un flusso medio stabile</td></tr><tr><td>Resina</td><td>Tecnologia Siraya</td><td>Nero fumé</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medio</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>30264-85</td><td></td></tr><tr><td>Setto per fiala in silicone/PTFE</td><td>Scienze GL Inc.</td><td>1030-50009</td><td></td></tr><tr><td>Alginato di sodio 80-120</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>194-13321</td><td></td></tr><tr><td>Programmi SPINit</td><td>RS2D</td><td></td><td>Software NMR nel polarizzatore DNP</td></tr><tr><td>Spugna</td><td>-</td><td>-</td><td>Spugna disponibile in commercio tagliata a misura per la stabilizzazione del gel</td></tr><tr><td>Rubinetto a tre vie</td><td>COME UNO</td><td>3-6247-04</td><td></td></tr><tr><td>Topspin</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software di acquisizione ed elaborazione dati NMR</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>07086-74</td><td></td></tr><tr><td>Resina polimerizzabile UV</td><td>BONDIC</td><td>BD-SKCJ</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>COME UNO</td><td>1-5832-41</td><td>Robot Termico TR Serie TR-1&alpha; per il mantenimento di 37 gradi Temperatura C</td></tr><tr><td>Wilmad Tubo NMR con tappo a vite</td><td>Sigma</td><td>Z271977</td><td>Frequenza 400 MHz, diametro 10 mm, lunghezza 178 mm.</td></tr></tbody></table>

rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante nmr iperpolarizzata a 13c

Real-Time Metabolic Detection in Living Cells Using Hyperpolarized 13C NMR

In questo studio, un sistema fabbricato è stato accoppiato alla spettroscopia NMR iperpolarizzata 13C per misurare il metabolismo del piruvato nelle cellule vive in tempo reale. I principali segnali rilevati nello spettro NMR 1D 13C corrispondevano al piruvato (circa 171 ppm) e al lattato (circa 183 ppm)21, permettendoci di valutare la conversione metabolica del piruvato in lattato in condizioni fisiologiche (Figura 4).
Qualità spettrale e dinamica del segnale I risultati rappresentativi di misurazioni ripetute sullo stesso campione utilizzando cellule SCCVII, una linea di carcinoma a cellule squamose di topo frequentemente utilizzata negli studi di risonanza magnetica iperpolarizzata, sono mostrati nella Figura 5. La prima misurazione ha mostrato un chiaro aumento del segnale del lattato, indicando una conversione metabolica attiva. Tuttavia, le misurazioni successive effettuate a intervalli di 1,5 ore hanno mostrato un progressivo declino dell'attività metabolica. Questa riduzione dipendente dal tempo riflette probabilmente lo stress biologico o l'adattamento indotto dall'iniezione iniziale di piruvato. In particolare, una simile modulazione metabolica transitoria è stata riportata in vivo utilizzando la risonanza magnetica iperpolarizzata e l'EPRI, dove l'ossigenazione del tumore è temporaneamente diminuita dopo la somministrazione di piruvato22. Questi risultati dimostrano che la ripetibilità di queste misurazioni consente il monitoraggio non distruttivo dei cambiamenti metabolici dinamici, un vantaggio difficile da ottenere con i metodi distruttivi23.
Per valutare l'applicabilità di questo protocollo ad altri tipi di cellule, sono state condotte ulteriori misurazioni utilizzando le cellule HeLa, una linea cellulare tumorale umana ampiamente utilizzata. Come mostrato nella Figura 6, le cellule HeLa hanno anche mostrato una chiara conversione da piruvato a lattato. Sebbene l'intensità del segnale sia gradualmente diminuita a causa del rilassamento del T1, il rapporto segnale/rumore è rimasto sufficiente per tutto il periodo di acquisizione di 60 s. Questi risultati suggeriscono che l'attuale protocollo è ampiamente applicabile e può fungere da strumento versatile per la profilazione metabolica in tempo reale in vari tipi di cellule.
Sebbene il rapido decadimento del segnale sia una limitazione intrinseca della risonanza magnetica nucleare basata su DNP, il nostro sistema di miscelazione in situ riduce al minimo il ritardo tra la dissoluzione e la misurazione, migliorando così la sensibilità di rilevamento. Ulteriori perfezionamenti, come l'ottimizzazione della composizione della matrice di gel, possono espandere l'applicabilità di questo metodo a una gamma più ampia di sistemi biologici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig1.jpg"> 
Figura 1: Diagramma schematico del flusso di lavoro complessivo dalla coltura cellulare alla misurazione NMR iperpolarizzata. Il processo inizia con la coltura cellulare (~2 settimane), seguita dalla preparazione del gel di alginato (~60 min) per incapsulare le cellule per una misurazione stabile. Successivamente, l'iperpolarizzazione viene eseguita utilizzando un sistema polarizzatore DNP (~60 min) e la misurazione NMR viene condotta utilizzando uno spettrometro NMR a 400 MHz (~5 min). Le fotografie a destra mostrano gli strumenti corrispondenti utilizzati in questo flusso di lavoro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig2.jpg"> 
Figura 2: Configurazione del bioreattore per la misura NMR iperpolarizzata. (A) Diagramma schematico della configurazione del bioreattore. Il terreno di coltura viene introdotto nella provetta NMR attraverso l'ingresso A e successivamente diretto verso i rifiuti. Le perle di alginato contenenti cellule vive vengono poste all'interno della provetta NMR. Durante le misure NMR iperpolarizzate, la sonda iperpolarizzata viene iniettata attraverso l'ingresso B, etichettato come ingresso della sonda iperpolarizzata. (B) Fotografia dell'intera configurazione del bioreattore, con i tubi di ingresso e uscita chiaramente etichettati. (C) Vista ravvicinata dell'interruttore del tubo di ingresso, che mostra l'ingresso A (perfusione media) e l'ingresso B (iniezione di sonda iperpolarizzata). (D) Progettazione CAD e (E) fotografia rappresentativa del componente di fissaggio in spugna stampato in 3D posizionato all'interno del tubo NMR. Il componente include un foro per guidare un capillare di vetro che eroga la soluzione di substrato iperpolarizzato e una piattaforma per contenere una spugna. Il componente stesso non si adatta perfettamente alla parete interna del tubo NMR; (F) invece, viene inserita una spugna attorno ad esso per riempire lo spazio. Questa struttura stabilizza il componente e consente al fluido di scarto di fluire verso l'alto attraverso la spugna, eliminando la necessità di un foro di uscita aggiuntivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig3.jpg"> 
Figura 3: Preparazione del gel di alginato. (A) Illustrazione schematica e (B) fotografia dell'apparato per la formazione di sfere di gel di alginato. L'immagine a sinistra mostra l'intera configurazione, compresa la provetta da centrifuga con una siringa fissata al coperchio modificato. L'immagine in alto a destra mostra un coperchio con un piccolo foro per la punta della siringa, mentre l'immagine in basso a destra mostra un coperchio con un'apertura quadrata per un posizionamento stabile della siringa. La provetta da centrifuga è pre-riempita con 10 mL di soluzione di cloruro di calcio, consentendo alla soluzione di alginato che esce dalla punta della siringa di subire la gelificazione, formando sfere di gel di alginato. (C) Immagine microscopica rappresentativa che mostra la morfologia delle palline di gel di alginato. (D) Immagine microscopica rappresentativa che mostra la morfologia di sfere di gel di alginato contenenti cellule HeLa. Barra della scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig4.jpg"> 
Figura 4: Rappresentazione schematica delle fasi di preparazione per la misura NMR e l'iperpolarizzazione. Durante il processo di accumulo DNP di ~60 minuti, la configurazione NMR viene eseguita in parallelo per ridurre al minimo i ritardi. La preparazione prevede il caricamento di perline di alginato nel tubo NMR, seguito dalla regolazione del blocco di 1ora, dallo spessore e dalla messa a punto della sonda per garantire che il sistema sia pronto per la misurazione immediata. Dopo la dissoluzione e la miscelazione in situ , la spettroscopia NMR a 13C risolta nel tempo rivela chiari picchi di piruvato e lattato. I picchi osservati a circa 171 ppm, 179 ppm e 183 ppm corrispondono rispettivamente al piruvato, al piruvato idrato e al lattato. Per la misurazione NMR sono state utilizzate circa 4 × 107 cellule HeLa incapsulate in gel di alginato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig5.jpg"> 
Figura 5: Rilevamento risolto nel tempo di segnali di piruvato e lattato in misurazioni ripetute. Gli spettri NMR iperpolarizzati 13C dello stesso campione incapsulato in cellule SCCVII sono stati acquisiti a intervalli di 1,5 ore per valutare la fattibilità di misure ripetute non distruttive. Le intensità di picco del piruvato (cerchi aperti) e del lattato (cerchi pieni, scalate di 1000×) sono tracciate nel tempo per ogni acquisizione. (A) Prima misurazione. (B) La seconda misurazione, dopo 1,5 ore, rivela una marcata riduzione della produzione di lattato. (C) La terza misurazione, dopo un'altra 1,5 ore, ha confermato una bassa attività metabolica sostenuta. L'analisi quantitativa basata sull'area sotto la curva (AUC) ha mostrato che il rapporto [Lattato]/[Piruvato] è diminuito da 0,00134 (prima misurazione) a 0,00019 (seconda) e 0,00027 (terza). La concentrazione finale di cellule nel gel di alginato era di circa 1,0 ×10-7 cellule/mL (4 × 10-7 cellule in 4 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig6.jpg"> 
Figura 6: Conversione del piruvato in lattato nelle cellule HeLa. I segnali NMR iperpolarizzati 13C risolti nel tempo di piruvato e lattato sono stati misurati in cellule HeLa vive. L'intensità del segnale del piruvato viene normalizzata al suo valore massimo al tempo zero. L'intensità del segnale del lattato è scalata di un fattore di 103 per la visibilità. L'analisi quantitativa basata sull'area sotto la curva (AUC) ha mostrato un rapporto [Lattato]/[Piruvato] di 0,00121. La concentrazione finale di cellule nel gel di alginato era di circa 7,5 × 106 cellule/mL (3 × 107 cellule in 4 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
Figura supplementare 1. Immagini rappresentative del setto della fiala utilizzato nel sistema del bioreattore. (A) Setto in silicone/PTFE (diametro 9 mm) prima dell'uso. (B) Lo stesso setto in uso effettivo, con tubo in PEEK inserito attraverso fori perforati. L'elasticità del materiale del setto gli consente di risigillarsi attorno al tubo, mantenendo condizioni di tenuta all'aria durante l'iniezione del substrato iperpolarizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S1.tif" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa figura</a>
Figura 2 supplementare: Spettro NMR 13C iperpolarizzato risolto nel tempo acquisito dopo miscelazione esterna. Spettro rappresentativo risolto nel tempo del metabolismo del piruvato [1-13C] misurato utilizzando un sistema NMR da banco dopo miscelazione esterna di piruvato iperpolarizzato e cellule al di fuori del tubo NMR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S2_RE.tif" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa figura</a>
File supplementare 1: Progettazione CAD del supporto cilindrico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Supplementary%20file%201_RE.ipt" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file</a>

Rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR iperpolarizzata a 13C

The protocol presents a method to integrate an in-house-built bioreactor system with hyperpolarized 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to ...

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Il miglioramento della sensibilità fornito dalla polarizzazione nucleare dinamica di dissoluzione (DNP) consente di seguire i processi metabolici in tempo reale tramite NMR e MRI. Vengono discusse le caratteristiche e le prestazioni di una configurazione DNP a dissoluzione dedicata, progettata per lo studio delle reazioni enzimatiche.

Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

Un fantoccio dinamico multi-compartimento viene utilizzato per simulare alcune biologie di interesse per studi metabolici utilizzando agenti di risonanza magnetica iperpolarizzata.

L&#39;uso di un multi-comparto dinamico singolo enzima Phantom per gli Studi di hyperpolarized Risonanza Magnetica Agents

La polarizzazione nucleare dinamica con successiva dissoluzione del campione ha permesso studi in tempo reale del metabolismo nei sistemi biologici. Il [1-13C]piruvato iperpolarizzato è stato utilizzato per studiare l'attività della lattato deidrogenasi in una linea cellulare di carcinoma prostatico in vitro.

hyperpolarized 13 C metabolica spettroscopia di risonanza magnetica e Imaging

Vi presentiamo un protocollo per misurare la dipendenza del campo magnetico del tempo di rilassamento spin-reticolo di 13composti arricchiti con C, iperpolarizzati per mezzo di polarizzazione nucleare dinamica, utilizzando una rilassantesi veloce ciclabile. In particolare, lo abbiamo dimostrato con [1-13C]pyruvate, ma il protocollo potrebbe essere esteso ad altri substrati iperpolarizzati.

Misurazione della dipendenza da campo magnetico di rilassamento Spin-Lattice di iperpolarizzato [1-13C]pyruvate

Questo protocollo descrive la configurazione di un bioreattore NMR per mantenere vitali le cellule umane incapsulate fino a 72 ore, seguito dall'acquisizione e dall'analisi dei dati NMR in-cell risolti nel tempo. La metodologia viene applicata per monitorare le interazioni intracellulari proteina-ligando in tempo reale.

Monitoraggio delle interazioni proteina-ligando nelle cellule umane mediante NMR quantitativa in-cellula in tempo reale utilizzando un bioreattore ad alta densità cellulare

Descriviamo una configurazione sperimentale per la somministrazione di metaboliti iperpolarizzati marcati con 13C in modalità di perfusione continua a un cuore di topo perfuso isolato. Un approccio di acquisizione dedicato a 13C-NMR ha permesso la quantificazione dell'attività enzimatica metabolica in tempo reale e un'analisi multiparametrica 31P-NMR ha permesso la determinazione del contenuto di ATP tissutale e del pH.

Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e spettroscopia NMR 13C / 31P

Lifetime Imaging di fluorescenza (FLIM) è emersa come una tecnica fondamentale per l'immagine l'ambiente e l'interazione di proteine ​​specifiche e coloranti nelle cellule viventi. FLIM fluorescenti di rotori molecolari consente mappatura di viscosità in cellule viventi.

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Abbiamo sviluppato un citofluorimetro mediante ultrasuoni laser indotto a rilevare in circolo cellule di melanoma come un indicatore precoce della malattia metastatica.

Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

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Contemporaneamente Catturare immagini in tempo reale in due canali di emissione Utilizzando un Splitting sistema Dual Camera Emissione: Applications to Cell Adhesion

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Rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR ^{iperpolarizzata a 13}C

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