Germinazione asimbiotica e rigenerazione a base di espianti di foglie dell'orchidea medicinale in via di estinzione Hemipilia cucullata da semi maturi

La mia ricerca si concentra sull'ottimizzazione dei protocolli di coltura tissutale per le orchidee in via di estinzione per migliorare la conservazione, la propagazione su larga scala e l'utilizzo sostenibile di queste preziose piante medicinali. Una delle sfide principali è ottenere tassi di germinazione e rigenerazione coerenti tra le specie di orchidee, poiché ciascuna richiede l'ottimizzazione dei terreni specifici per specie e il controllo preciso delle condizioni di crescita. Abbiamo sviluppato protocolli efficienti di coltura tissutale per diverse piante in via di estinzione, consentendo il recupero delle specie e supportando la ricostruzione negli habitat naturali.

Non esiste un sistema di coltura tissutale efficiente e riproducibile per l'Hemipilia cucullata che gestisce la propagazione, il restauro e la conservazione. Le orchidee terrestri hanno spesso bisogno di specifici funghi simbiotici il cui isolamento e identificazione sono complessi. Un metodo simbiotico semplifica la propagazione e bypassa questi passaggi.

La nostra pratica consente un'elevata germinazione e la rapida rigenerazione delle piante dagli stati maturi, eliminando la dipendenza fungina e offrendo un approccio più rapido e affidabile per la propagazione dell'Hemipilia cucullata. Per iniziare, posizionare la capsula in un becher. Aggiungere una o due gocce di detersivo nel becher per il risciacquo.

Lavare la capsula sotto l'acqua corrente del rubinetto per cinque minuti. Quindi, utilizzando carta assorbente sterile, rimuovere l'acqua superficiale rimanente dalla capsula. Ora, immergi la capsula in etanolo al 75% per 30 secondi.

Sterilizzare la capsula immergendola in 50 millilitri di soluzione di ipoclorito di sodio al 20% contenente circa il 5% di cloro disponibile. Quindi aggiungere due gocce di detersivo per piatti per la casa non diluito alla soluzione e incubare la capsula per 10-12 minuti. Sciacquare la capsula cinque volte con acqua distillata sterile per rimuovere eventuali residui di disinfettante.

Quindi, utilizzando un bisturi sterile, rimuovere circa un millimetro sia dall'apice che dall'estremità peduncolare della capsula. Fai una piccola incisione all'estremità superiore della capsula per esporre i semi e raccoglierli in una capsula di Petri sterile. Utilizzando una pinza sterile, disperdere uniformemente circa 500-600 semi in ogni bottiglia di coltura contenente il terreno preparato.

Lascia che i semi assorbano l'acqua e si depositino sul fondo del mezzo liquido. Mantenere le colture a 25 gradi Celsius con un ciclo di luce e buio di 12 ore e un'intensità luminosa di 36 micromoli per metro quadrato al secondo. Osserva settimanalmente la germinazione dei semi.

Registra eventuali cambiamenti morfologici visibili e fotografa le colture per la documentazione. Seleziona piantine sane di uno o due centimetri di dimensione senza annerimento visibile o ingiallimento completo per l'allungamento dei germogli. Utilizzando una pinza sterilizzata e raffreddata, trasferire asetticamente 8-12 piantine in ogni bottiglia contenente il terreno di allungamento dei germogli appena preparato.

Distribuire uniformemente le piantine all'interno di ogni bottiglia. Dopo cinque settimane di allungamento dei germogli, selezionare le piantine con germogli completamente sviluppati e foglie sane per il campionamento dell'espianto delle foglie. Accisa le foglie sterili completamente espanse da una piantina sana usando il bisturi sterile.

Rimuovi la regione apicale e i margini delle foglie. Quindi tagliare ogni foglia in segmenti di circa 0,5 x 0,5 centimetri utilizzando un bisturi sterile in condizioni asettiche. Posizionare 10 segmenti di foglia sul mezzo di induzione PLB con la superficie adassiale rivolta verso l'alto.

Assicurati che ogni segmento tocchi saldamente il mezzo. Quindi coltivali per cinque settimane. Infine, valutare il numero di PLB indotti con successo e calcolare il tasso di induzione in percentuale.

Registra l'altezza media delle gemme in centimetri e conta il numero di gemme formate per espianto. La germinazione dei semi in mezzo liquido è stata visibilmente caratterizzata dall'emergere di embrioni verdi dal rivestimento del seme a circa 60 giorni, che successivamente hanno formato protocormi sferici da 80 a 85 giorni. Il tasso di germinazione più alto del 72% è stato raggiunto in terreno liquido integrato con 0,5 milligrammi per litro di NAA.

Il terreno B5 contenente 0,5 milligrammi per litro di benziladenina e 0,2 milligrammi per litro di NAA ha prodotto il più alto tasso di proliferazione del protocormo, con una media di 5,3 protocormi di nuova formazione per espianto. I protocormi coltivati in terreno B5 con la combinazione ottimizzata di regolatori di crescita hanno mostrato una crescita vigorosa e una pigmentazione verde sana, superando quelli coltivati su terreno MS nelle stesse condizioni. Il numero più alto di rami per piantina, in media quattro, è stato osservato con un milligrammo per litro di ciascuna benziladenina e NAA, seguito da vicino dal solo NAA a 0,5 milligrammi per litro.

L'allungamento dei germogli è stato più migliorato con la combinazione di 0,5 milligrammi per litro di benziladenina e un milligrammo per litro di NAA, con un'altezza media della piantina di 4,8 centimetri. Il più alto tasso di induzione dei corpi protocorm-like, 44,3%, è stato raggiunto utilizzando tre milligrammi per litro di benziladenina con 0,2 milligrammi per litro di NAA.