Caratterizzazione con imaging dal vivo dei movimenti del centromero durante la profase meiotica maschile in Arabidopsis thaliana

La nostra ricerca esplora la meiosi vegetale, con l'obiettivo di scoprire i meccanismi molecolari che guidano il riconoscimento, l'allineamento e l'accoppiamento dei cromosomi omologhi durante la progressione dei meiotici. La sfida è visualizzare il movimento cromosomico nei profili meiotici, richiedendo immagini di tessuti vivi ad alta risoluzione e velocità per tracciare le traiettorie. Per cominciare, rimuovi la pellicola protettiva del distanziatore su un lato e posizionala al centro di una lama di vetro.

Poi rimuovi la seconda pellicola protettiva. Deposita otto microlitri di acqua del rubinetto al centro del distanziatore. Usando la pinza, scegli un'infiorescenza da uno dei fusti principali.

Posizionare l'infiorescenza su un nuovo vetrino posizionato sotto un microscopio stereoscopico dotato di un righello. Seleziona boccioli fioriali che misurano circa 0,5 millimetri di lunghezza. Usando aghi affilati, apri delicatamente i boccioli separando sepali e petali per trattenere solo le antere.

Trasferisci delicatamente i grappoli dell'antera nell'acqua nella cavità distanziatrice subito dopo aver rimosso sepali e petali per evitare la disidratazione. Deposa diversi altri grappoli all'interno della cavità distanziale. Per coprire il vetrino con un copricapo evitando le bolle d'aria, aggiungi otto microlitri d'acqua su un spostino.

Poi inverti con attenzione il slip di copertura con la goccia d'acqua rivolta verso la cavità distanziatrice. Assicurati che i grappoli delle antere siano immersi in un totale di 16 microlitri d'acqua e che il slip di copertura aderisca bene allo distanziatore. Installare il microscopio eccitando GFP a 488 nanometri e rilevandola con un rivelatore ibrido tra 494 e 547 nanometri.

Poi localizza l'antera usando l'illuminazione a campo chiaro. Utilizzando il canale del campo chiaro, determina lo stadio meiotico in base alla forma delle cellule. Visualizza l'antera sul software e usa il segnale RFP come indicatore aggiuntivo dello stadio meiotico delle cellule.

Per effettuare acquisizioni continue, impostare l'intervallo di tempo a zero nella sezione temporale. Poi usa il modulo spot per tracciare automaticamente le macchie. Scegli il canale sorgente verde e imposta il diametro XY a un micrometro per il centromero contrassegnato GFPCENH3.

Successivamente modifica la qualità del rilevamento in base all'intensità del segnale usando il grafico in basso nella finestra di controllo. Utilizza l'algoritmo di tracciamento del movimento regressivo automatico per tracciare le traiettorie del centromero e visualizzare tutte le traiettorie per distinguere facilmente i meiociti dai tessuti somatici. Successivamente, usa il modulo spot per tracciare le macchie nel tempo sul nucleo selezionato.

Definisci una regione di interesse selezionando il segmento di opzione solo una regione di interesse ed esegui il tracking spot al suo interno. Seleziona una regione di interesse che includa correttamente il nucleo in tutte e tre le dimensioni e nel tempo. In un grafico di discendenza, usa il visualizzatore 3D del software per visualizzare tutte le traiettorie.

Rimuovi le traiettorie fuori dal meiocita analizzato selezionandole e premendo il tasto delete sulla tastiera. In modalità modifica, elimina o aggiungi un oggetto, assicurandoti che l'oggetto venga aggiunto nel piano corretto. In modalità modifica tracce, collega manualmente i nuovi oggetti nel grafico di lineage dopo aver analizzato accuratamente la cella in 3D.

Calcola la velocità istantanea a ogni passo temporale per monitorare le variazioni della velocità di movimento nel tempo. Calcola l'angolo di sterzata come il cambiamento della direzione del movimento tra passi temporali consecutivi per rivelare i pattern di traiettoria. Memorizza il risultato insieme alla velocità istantanea.

Calcola il rapporto di outreach usando il cell tracker per misurare quanto si muove un oggetto tracciato rispetto alla sua posizione iniziale, indicando il comportamento esplorativo. Calcola la velocità media per ogni tracciato per riassumere le caratteristiche di movimento durante il periodo di osservazione. Calcola l'angolo medio di sterzata per tracciato per analizzare movimento, direzionalità e modelli comportamentali e memorizza il risultato.

Successivamente, calcola la dimensione del centroide a ogni passo temporale per misurare la dispersione spaziale dei centromeri attorno alla loro posizione media. Utilizzare variazioni nella dimensione del centroide nel tempo per valutare la coerenza globale tra le tracce del centromero e memorizzare il risultato. Calcolare la correlazione incrociata della velocità per analizzare le relazioni tra le dinamiche di movimento di diversi oggetti tracciati, rivelando potenziali comportamenti coordinati.

Poi calcola lo spostamento quadratico medio per ogni traccia per quantificare la distanza quadratica media percorsa dai centromeri in un dato intervallo di tempo. I centromeri meiotici hanno mostrato una velocità media significativamente più alta di 109,35 nanometri al secondo rispetto ai centromeri somatici. I centromeri meiotici hanno mostrato un range più ampio e un rapporto di diffusione normalizzato più alto rispetto ai centromeri somatici.

La distribuzione dell'angolo di rotazione differiva tra centromeri meiotici e somatici. Lo spostamento quadratico medio dei centromeri meiotici aumentò nel tempo mentre i centromeri somatici rimasero in gran parte statici. Questo protocollo ha permesso la quantificazione per la prima volta del movimento cromosomico meiotico in Arabidopsis, rivelando dinamiche drammatiche dei centromeri durante la fase di zigotene e pachitene.

Questo protocollo consente di studiare i movimenti delle regioni genomiche durante la profase meiotica e può essere adattato per l'applicazione in altre specie vegetali. Questo lavoro consente di esplorare il movimento cromosomico e l'interazione tra ricombinazione, approfondiscando la comprensione dei meccanismi che guidano la diversità genetica durante la formazione dei gameti vegetali.