Name: Sovraespressione e purificazione di una nucleasi tossica da Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Impara a sovraesprimere e purificare la nucleasi tossica Nsp15 da Escherichia coli utilizzando cromatografia di affinità ed esclusione molecolare. Questo metodo facilita studi biochimici e strutturali su nidovirus.

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<ol><li>Francis, D. M., Page, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+optimize+protein+expression+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies to optimize protein expression in E. coli.</a> Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).</li>
<li>Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicity+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%3A+a+comparison+of+overexpression+in+BL21%28DE3%29%2C+C41%28DE3%29%2C+and+C43%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3).</a> Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).</li>
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<li>Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-convoluting+the+genetic+adaptations+of+E.+coli+C41%28DE3%29+in+real+time+reveals+how+alleviating+protein+production+stress+improves+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields.</a> Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).</li>
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<li>Nedialkova, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+arterivirus+nonstructural+protein+11+reveals+the+nidovirus-wide+conservation+of+a+replicative+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease.</a> J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+endoribonuclease+ensures+efficient+viral+replication+and+prevents+protein+kinase+R+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation.</a> J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).</li>
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<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+for+endoribonuclease+nsp15-mediated+regulation+of+alpha-coronavirus+propagation+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence.</a> Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).</li>
<li>Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+SARS+virus+nsp15+endoribonuclease%3A+identification+of+residues+affecting+hexamer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).</li>
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<li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+SARS-CoV-2+endoribonuclease+nsp15+reveal+insight+into+nuclease+specificity+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics.</a> Nat Commun. 12 (1), 636(2021).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+nsp15+endoribonuclease+NendoU+from+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2.</a> Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).</li>
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<li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease+antagonizes+dsRNA-induced+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).</li>
<li>Wang, X., Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+preferentially+degrades+AU-rich+dsRNA+via+its+dsRNA+nickase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).</li>
<li>Zheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+evolution+of+nidovirus+endoribonuclease+based+on+the+finding+that+nsp15+from+porcine+deltacoronavirus+functions+as+a+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer.</a> J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).</li>
<li>Huang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+RNA+cleavage+by+coronavirus+nsp15+endonuclease%3A+evidence+for+acid-base+catalysis+and+substrate-dependent+metal+ion+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation.</a> J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characterization+of+endoribonuclease+nsp15+encoded+by+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus.</a> J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).</li>
<li>Jernigan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+structural+studies+of+SARS-CoV-2+protein+NendoU+with+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser.</a> Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).</li>
<li>Ricagno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+nsp15+from+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).</li>
<li>Canal, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+SARS-CoV-2+antiviral+compounds+by+screening+for+small+molecule+inhibitors+of+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease.</a> Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).</li>
<li>Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+nsp15+protein+is+an+endoribonuclease+that+prefers+manganese+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor.</a> J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).</li>
<li>De Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+successful+recombinant+expression+of+disulfide+bond-dependent+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli.</a> Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m PES, Sterilizzante, Basso legame proteico, Sistema di filtraggio, 1 L</td><td>Corning</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della serina proteasi AEBSF</td><td>Goldbio</td><td>30827-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Agar, batteriologico</td><td>Amresco</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Sistema di purificazione KTA go</td><td>Citiva</td><td>29383015</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore MWCO Amicon Ultra 15 mL, 30 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sodica</td><td>Goldbio</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>Palloni a scuotimento deflettori</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>F0527</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5920R</td><td></td></tr><tr><td>Biofotometro plus</td><td>Eppendorf</td><td>E-BP6132</td><td></td></tr><tr><td>Trombina bovina</td><td>BioPharm</td><td>91-030</td><td></td></tr><tr><td>reagente colorante Bradford</td><td>Boston Bioprodotti</td><td>BPA-200</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114931</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Visualizzazione del materiale C4901</td><td></td></tr><tr><td>Bagno a secco digitale</td><td>Rabbia bio</td><td>1660562</td><td></td></tr><tr><td>Spandiconcime monouso, a forma di L</td><td>Partner MedSupply</td><td>62-1014-1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Goldbio</td><td>27565-41-9</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI da pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Macina tessuti Douce, 40 mL</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Colonne per cromatografia econo-colonna</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1532</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore nutatore Enduro minimix</td><td>Rete di laboratorio</td><td>S0600</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25R Inc/Ref Agitatore</td><td>Eppendorf</td><td>NB-E25R</td><td></td></tr><tr><td>FastPette V2</td><td>Rete di laboratorio</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso Fiberlite F10-4x1000 LEX</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>096-041075</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso Fiberlite F21-8x50y</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>096-084275</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Imager</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore con piastra riscaldante</td><td>VWR</td><td>12365-346</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>VWR</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>Goldbio</td><td>I-902-25</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-szlig;-D-tiogalattoside (IPTG)</td><td>Goldbio</td><td>Codice 12481C25</td><td></td></tr><tr><td>Cellule di E. coli competenti Lemo21(DE3)</td><td>Biolaboratori del New England</td><td>C2528J</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di manganese(II) tetraidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Codice: M3634</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga, 1,7 mL</td><td>Partner MedSupply</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga, 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>Cella per elettroforesi verticale a tetra Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad</td><td>10025025</td><td></td></tr><tr><td>Gel Mini-Proteiforme di Tris-glicina, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>4568094</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge mini centrfugo</td><td>Partner MedSupply</td><td>C1008-B</td><td></td></tr><tr><td>Flacone da centrifuga superveloce Nalgene da 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>3141-1006</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga Nalgene oak ridge</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>31139-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotometro</td><td>Implen</td><td>3769</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice non agitante</td><td>Rete di laboratorio</td><td>I 5110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Celle Overexpress C41(DE3) chimicamente competenti</td><td>Tecnologie di bioricerca</td><td>60442-1</td><td></td></tr><tr><td>Celle Overexpress C41(DE3) chimicamente competenti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMC0017</td><td>Interrotto; Le cellule Biosearch C41(DE3) o le cellule NEB Lemo21 sono un'alternativa</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Partner MedSupply</td><td>62-1077-3</td><td></td></tr><tr><td>Plasmidi (spina dorsale pET-14b)</td><td>Genscript</td><td>Ordine personalizzato</td><td></td></tr><tr><td>Micro-cuvette in plastica</td><td>Fisher Scientifico</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>PowerPacalimentazione universale</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Ago di scorrimento di precisione</td><td>Becton Dixon</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Standard di precisione e proteine non colorate</td><td>Bio-Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di recupero per l'espressione&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMR0001K</td><td></td></tr><tr><td>Rotore a benna oscillante S-4x1000</td><td>Eppendorf</td><td>EP-S4X1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica, 10 mL</td><td>Faclon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica, 25 mL</td><td>Faclon</td><td>35725</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica, 5 mL</td><td>Faclon</td><td>35743</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica, 50 mL</td><td>Pr1ma</td><td>PR-SIERO-50</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Dismembratore sonico</td><td>Fisher Scientifico</td><td>Pannello FB505</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall Lynx 4000</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Spephadex G-25 M PD-10</td><td>Citiva</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-Mercaptoetanolo</td><td>Millipore</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere Griffin in acciaio inox</td><td>Ceramica polare</td><td>13977-010-EA</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon sterili, 15 mL</td><td>Falcone</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon sterili, 50 mL</td><td>Falcone</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Superdex 200 10/300 GL</td><td>Citiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe, 1 mL</td><td>Aria-Tite&nbsp;</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe, 3 mL</td><td>Becton Dixon</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Resina di affinità per metalli TALON</td><td>Takara</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Stuzzicadenti</td><td>Via della Creatività</td><td>PAC3690-01</td><td></td></tr><tr><td>Base tris</td><td>Goldbio</td><td>T-400-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biomedicali</td><td>807423</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Prodotti di ricerca internazionale</td><td>Codice: T60065</td><td></td></tr><tr><td>Vornado</td><td>Benchmark</td><td>BV101-G</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Prodotti di ricerca internazionale</td><td>Y20025</td><td></td></tr></tbody></table>

sovraespressione e purificazione di una nucleasi tossica da escherichia coli

Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from Escherichia coli

A causa della tossicità di Nsp15 come nucleasi, di solito era necessario un totale di ~7 ore perché le colture starter raggiungessero un OD600 di 0,8-1,0. Una volta inoculato, era tipicamente necessario un totale di ~3-5 ore per lo stesso OD600 ottimale di 0,8-1,0 per l'induzione. In questo caso, il tempo di raddoppio sembrava essere ~1 h. Quando è stato espresso un mutante catalitico-morto di Nsp15, il raddoppio per le cellule di E. coli è apparso normale (~20 min), ulteriore prova che l'a...

Sovraespressione e purificazione di una nucleasi tossica da Escherichia coli

Escherichia coli has been widely employed as an expression system to produce recombinant proteins. Yet some types of recombinant proteins, such as ...

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Trasduzione proteina consente la fornitura diretta di proteine ​​biologicamente attive nelle cellule. A differenza dei metodi tradizionali come la transfezione di DNA o di trasduzione virale questo non invasivo consente paradigma altamente efficiente manipolazione cellulare in modo titolabile eludere tossicità cellulare e il rischio di trasformazione oncogena permanente da modificazione genetica.

Ingegneria Cell-permeabile proteine

Sistematiche e su larga scala di sintesi genetica (gene-gene o epistasi) schermi di interazione può essere utilizzato per esplorare la ridondanza genetica e via di cross-talk. Qui, descriviamo un high-throughput quantitativa sintetica genetica tecnologia di retinatura array, definito eSGA che abbiamo sviluppato per chiarire i rapporti epistatiche ed esplorare reti di interazione genetici...

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Le esonucleasi svolgono un ruolo fondamentale nel garantire la stabilità del genoma. La perdita della funzione dell'esonucleasi WRN provoca un invecchiamento precoce. Lo studio dei substrati e di altri requisiti della nucleasi in vitro può aiutare a chiarire il suo ruolo in vivo. Qui dimostriamo un saggio rapido e riproducibile basato sulla fluorescenza per misurare la sua attività nucleasica.

Un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per caratterizzare DmWRNexo, ortologo dell'esonucleasi WRN progeroide umana, e la sua applicazione ad altre nucleasi

Questo protocollo di cinque giorni delinea tutte le fasi, attrezzature e software supplementare necessario per la creazione e l'esecuzione di un sistema di espressione TX-TL cell-free da zero efficiente Escherichia coli endogeno basato. Con i reagenti, il protocollo dura 8 ore o meno per impostare una reazione, raccogliere e elaborare i dati.

Protocolli per l'implementazione di un Escherichia coli Sulla base TX-TL cellulare-Free Expression System per la biologia sintetica

La co-espressione proteica è una potente alternativa alla ricostituzione in vitro di complessi proteici ed è di aiuto nell'esecuzione di test biochimici e genetici in vivo. Qui riportiamo l'uso della co-espressione proteica in Escherichia coli per ottenere complessi proteici e per regolare la frequenza di mutazione delle cellule.

I benefici multiforme Protein Co-espressione in<em&gt; Escherichia coli</em

Un metodo ad alto rendimento per un solo passaggio di purificazione negativo ricombinante Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine ​​(HP-NAP) sovraespresso in Escherichia coli utilizzando resine dietilamminoetil in modalità batch è descritta. HP-NAP purificata da questo metodo è utile per lo sviluppo di vaccini, farmaci, o diagnostica per H. pylori -associated malattie.

Un passo negativo cromatografica Purificazione di<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofili-attivazione della proteina sovraespresso in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In modalità batch

Un semplice protocollo di sovraespressione e di purificazione della cis -preniltransferasi umana ottimizzata dal codone, in condizioni non denaturanti, da Escherichia   Coli , è stato descritto, insieme ad un test enzimatico di attività. Questo protocollo può essere generalizzato per la produzione di altre proteine ​​di cis- preniltransferasi in quantità e qualità adatte agli studi meccanici.

Sovrapressione e purificazione dell'uomo Cis -preniltransferasi in<emescherichia coli></emescherichia>

Qui presentiamo un protocollo per l'uso di pre-esistente antibiotico resistenza-cassette eliminazione costrutti come base per la fabbricazione di mutanti di delezione in altri ceppi di Escherichia coli . Tali mutazioni di omissione possono essere mobilitati e inseriti il locus corrispondente di un ceppo destinatario mediante trasduzione del batteriofago P1.

Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa

Protocatechuate 3,4-diossigenasi (PCD) può rimuovere ezimaticamente l'ossigeno diatomico libero da un sistema acquoso utilizzando il suo acido protocatechuico del substrato (PCA). Questo protocollo descrive l'espressione, la purificazione e l'analisi dell'attività di questo enzima di scavenging dell'ossigeno.

Espressione e purificazione di Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Diossigenasi

Le endonucleasi di restrizione con nuova specificità della sequenza possono essere sviluppate da enzimi che riconoscono una sequenza parzialmente degenerata. Qui forniamo un protocollo dettagliato che abbiamo usato con successo per alterare la specificità della sequenza dell'enzima NlaIV. Gli ingredienti chiave del protocollo sono la compartimentazione in vitro della reazione di trascrizione/traduzione e la selezione di varianti con nuove specificità di sequenza.

In Vitro Diretto Evoluzione di una restrizione Endonucleato con più stringente specificità

I batteri secernono vescicole extracellulari (EV) di dimensioni nanometriche che trasportano molecole biologiche bioattive. La ricerca EV si concentra sulla comprensione della loro biogenesi, del ruolo nelle interazioni e malattie microbo-microbo e ospite-microbo, nonché sulle loro potenziali applicazioni terapeutiche. Viene presentato un flusso di lavoro per l'isolamento scalabile dei veicoli elettrici da vari batteri per facilitare la standardizzazione della ricerca sui veicoli elettrici.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Impara a sovraesprimere e purificare la nucleasi tossica Nsp15 da Escherichia coli utilizzando cromatografia di affinità ed esclusione molecolare. Questo metodo facilita studi biochimici e strutturali su nidovirus.

Sovraespressione e purificazione di una nucleasi tossica da Escherichia coli

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