Estrazione degli istoni da campioni clinici per profilazione epigenetica tramite spettrometria di massa

L'ambito della nostra ricerca è analizzare i cambiamenti epigenetici nei campioni di cancro, scoprire nuovi biomarcatori diagnostici e prognostici e identificare potenziali bersagli per la terapia. Una delle principali difficoltà con i campioni clinici è il materiale limitato e gli artefatti indotti dalla fissazione. Tuttavia, con il nostro flusso di lavoro ottimizzato e la sensibilità di MS, possiamo quantificare fino a 50 PTM di istoni da sole 1000 cellule.

Dimostriamo che la spettrometria di massa può quantificare i cambiamenti del PTM degli istoni nel campione clinico, offrendo informazioni sui meccanismi epigenetici e permettendo la scoperta di biomarcatori e l'identificazione dei bersagli farmacologici per terapie epigenetiche di precisione. Il nostro protocollo affronta la necessità di una profilazione robusta, quantitativa e sensibile sulla PTM degli istoni in vari tipi di campioni clinici. La spettrometria di massa è ideale per l'analisi PTM degli istoni, offrendo rilevamento non polarizzato, profilazione simultanea e co-presenza sullo stesso peptide, superando così le limitazioni dei metodi basati su anticorpi.

Per cominciare, scongelare il tessuto fresco congelato su ghiaccio e, usando un bisturi o una lama, tagliare un pezzo di circa 20-30 milligrammi corrispondente a circa due millimetri cubi di tessuto. Trasferire il campione di tessuto tagliato in un tubo da 1,5 millilitri. Con delle forbici, trita il tessuto in piccoli pezzi.

Aggiungere un millilitro di tampone di isolamento dei nuclei appena preparati, integrato con gli inibitori proteasi specificati, e tritare nuovamente il tessuto. Trasferisci il campione a un omogeneizzatore verso il basso. Usando prima il penello sciolto e poi il penello stretto, omogeneizza il tessuto finché non restano pezzi visibili a occhio nudo.

Filtrare il campione omogeneizzato attraverso un colino cellulare da 100 micrometri per eliminare i detriti tissutitori. Pipetta vigorosamente il campione filtrato su e giù usando una pipetta da 200 microlitri per dissolvere la membrana plasmatica. Trasferire il campione in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.

Inserire il tubo in una centrifuga da banco e far girare a 2.300 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per mettere i nuclei in pellet. Dopo aver scartato il sovrantante, risospendere il pellet nucleare in 50-100 microlitri di buffer di isolamento dei nuclei, integrato con SDS allo 0,1% per sciogliere la membrana nucleare. Poi aggiungere 250 unità di nucleasi Benzonasi al campione risospeso per digerire gli acidi nucleici.

Mescola bene e incuba per due minuti a 37 gradi Celsius. Per una temperatura di taglio ottimale, i campioni congelati, lavare i tessuti con acqua etanolica e PBS prima di tritare e estrarre istoni. Aggiungere un millilitro di agente dissolvente di paraffina al campione FFPE, prelevato in un tubo da 1,5 millilitri e far girare un vortice alla massima velocità per 30 secondi finché la paraffina non si dissolve completamente.

Centrifugare il campione a 16.000 G per tre minuti a temperatura ambiente e scartare con cura il surnatante usando una pipetta dotata di una piccola punta evitando il pellet. Ora aggiungi un millilitro di etanolo al 95% al pellet e al vortice alla massima velocità per 30 secondi. Centrifugare il campione a 16.000 G per tre minuti a temperatura ambiente e scartare il soprantantante.

Dopo aver reidratato il campione, aggiungi 200 microlitri di tampone di estrazione al pellet. Omogeneizza il tessuto nel buffer di estrazione fornicando con un significante digitale usando una punta micro da tre millimetri. Dopo l'omogeneizzazione, incubare il campione in un termomiscelatore e aprire brevemente il coperchio del tubo per far evaporare il formaldeide.

Dopo aver centrifugato il campione, trasferire il sovrantantante in un nuovo tubo etichettato. Rimuovere le bande di gel corrispondenti al peso molecolare delle proteine istoniche centrali situate tra 10 e 18 kilodaltoni utilizzando un bisturi. Dopo aver tagliato le fasce di gel, usa lo stesso bisturi per trasferire i pezzi di gel tagliati in un tubo da 1,5 millilitri.

Per eliminare il gel, aggiungi una soluzione del 50% di acetonitrile in acqua doppiamente distillata e incuba il tubo in un termomiscelatore a 1.400 giri al minuto per 10 minuti a temperatura ambiente. Disidrata i pezzi di gel aggiungendo 100% acetonitrile. Mescola il termomixer a 1.400 giri al minuto per 10 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver scartato il surnante, asciugare i pezzi di gel per cinque minuti a temperatura ambiente in una centrifuga a vuoto. Successivamente, aggiungere 15 microlitri di soluzione di proponicanidride a 7,7 molari e 26 microlitri di un molare bicarbonato di ammonio in ciascun tubo e incubare. Poi incubare il campione con 80 microlitri di bicarbonato di ammonio molare uno.

Poi lava i pezzi di gel tre volte con acqua distillata doppia e scarta il liquido dopo ogni incubazione. Successivamente, aggiungi il 50% di acetone nitrile ai pezzi di gel e incuba a 1.400 giri al minuto per 15 minuti a temperatura ambiente. Poi aggiungi il 100% acetonitrile per disidratare completamente i pezzi di gel.

Incubare nel termomiscelatore a 1.400 giri al minuto per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il liquido, asciuga i pezzi di gel per cinque minuti a temperatura ambiente in una centrifuga a vuoto. Aggiungi quattro microlitri di soluzione di tripsina e 20 microlitri di buffer di digestione a ogni tubo contenente pezzi di gel.

Incubare i tubi sul ghiaccio per 10 minuti per permettere l'assorbimento della tripsina nel gel. Una volta che la tripsina è completamente assorbita, aggiungi 80 microlitri di buffer digestionale per coprire completamente i pezzi di gel e incuba i tubetti durante la notte a 37 gradi Celsius in un termomiscelatore. Per estrarre i peptidi digeriti, aggiungere 100 microlitri di nitrile al 100% aceto in ogni tubo e incubare a 1.400 giri al minuto per 20 minuti a temperatura ambiente in un termomiscelatore.

Ora, raccogli con cura il surnatante e trasferiscilo in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Dopo aver ripetuto l'estrazione con nitro aceto con il gel rimanente, raccogli i soprantatori. Concentrare i peptidi aggregati in una centrifuga a vuoto finché il volume non è compreso tra uno e cinque microlitri.

Poi aggiungi due microlitri di bicarbonato trietilammonio molare e tre microlitri di soluzione di fenil isocianato. Incubare il campione a 350 giri al minuto per 90 minuti a 37 gradi Celsius in un termomiscelatore. Per fermare la derivizzazione, aggiungere otto microlitri di acido tricloroacetico all'1% a ciascun tubo.

Infine, diluire ogni campione aggiungendo 100 microlitri di tampone A e caricare i campioni diluiti sulle punte dello stadio C18 per l'eluzione. L'estrazione degli istoni è stata realizzata con successo da campioni freschi congelati, OCT congelati e FFPE utilizzando flussi di lavoro differenziali specifici per ciascun tipo di tessuto. Nonostante un arricchimento e una presenza proteica di fondo inferiori, gli istoni H3, H2A, H2B e H4 sono stati estratti con successo da campioni FFPE, come dimostrato dalle bande nelle FFPE1 e FFPE2 di Lane, allineandosi con circa un microgrammo dello standard H3.1.

La nanocromatografia liquida e l'analisi MS degli istones derivati dal FFPE hanno mostrato una separazione riuscita dei peptidi degli istoni su un gradiente di 55 minuti con picchi di tempo di ritenzione chiari mostrati nel cromatogramma ionico totale. I cromatogrammi ionici estratti hanno confermato la rilevazione e la quantificazione delle forme non modificate e metilate di H3 K quattro con profili di eluzione separati per ciascun valore M per Z. Abilitando il calcolo della percentuale di abbondanza relativa per ogni modifica.

L'analisi comparativa delle modifiche degli istoni tra campioni normali e tumorali ha rivelato aumenti significativi in alcuni tipi e una diminuzione di altri tipi nei tessuti tumorali.