Name: Utilizzo degli strumenti di optogenetica LEXY e LINuS e dellanalisi automatizzata delle immagini per quantificare le dinamiche di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Scopri l'analisi automatizzata delle immagini per quantificare le dinamiche di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive utilizzando strumenti di optogenetica. Questo metodo migliora l'efficienza nello studio dei meccanismi cellulari.

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<ol><li>Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyopherin-mediated+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).</li>
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<li>Forlani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+slow-cycling+variants+of+the+light-inducible+nuclear+protein+export+system+LEXY+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).</li>
<li>Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+blue+light+transmission+area+in+living+animals+using+light-induced+nuclear+translocation+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).</li>
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<li>Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAc+modification+of+nuclear+pore+complexes+accelerates+bidirectional+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport.</a> J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).</li>
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L'importanza del trasporto nucleocitoplasmatico (NCT) per regolare le principali vie cellulari e mantenere l'omeostasi cellulare è stata ben studiata negli ultimi anni1. Di conseguenza, sono stati generati diversi strumenti per studiare la dinamica dell'NCT 2,3,4. Tra questi strumenti, le sonde optogenetiche LINuS5 e LEXY6, pubblicate rispettivamente nel 2014 e nel 2016, forniscono un modo potente per monitorare l'NCT nelle cellule vive. Questi strumenti, progettati per seguire l'esportazione inducibile (LEXY) o l'importazione (LINuS) di un reporter fluorescente, sono inducibili dall'esposizione alla luce blu e reversibili.
In breve, queste due piccole sonde utilizzano le proprietà del dominio LOV2 della proteina fototropina-1 della pianta Avena sativa7. In assenza di luce blu, l'elica Jα del dominio LOV2 viene fotoingabbiata e incorporata nel nucleo proteico. Poiché l'elica Jα può rispondere agli stimoli luminosi, l'illuminazione da parte della luce blu induce un cambiamento conformazionale e il successivo sganciamento dell'elica Jα dal dominio LOV2. Gli autori di LEXY e LINuS hanno utilizzato questa sensibilità alla luce per fondere un segnale di localizzazione nucleare (NLS) o un segnale di esportazione nucleare (NES) all'elica Jα, rispettivamente per LINuS e LEXY (Figura 1). Lo strumento risultante è una sonda che trasloca nel nucleo (LINuS) o nel citosol (LEXY) dopo l'illuminazione a luce blu.
Per tracciare le sonde con l'imaging fluorescente, è stato aggiunto anche un reporter fluorescente mCherry ai costrutti. Infine, un debole NES (per LINuS) o NLS (per LEXY) è stato aggiunto al sistema per garantire che le sonde non fossero nella loro localizzazione finale prima dell'illuminazione della luce blu, il che avrebbe impedito l'osservazione della traslocazione di LEXY o LINuS tra il nucleo e il citosol.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg"> 
Figura 1: Rappresentazione delle sonde LEXY e LINuS. Entrambe le sonde sono costituite da una proteina mCherry fusa al dominio LOV2 sensibile alla luce. La differenza tra i due strumenti risiede nella sequenza di segnalazione nascosta dall'elica Jα: un NES per LEXY e un NLS per LINuS. Entrambe le sonde possiedono anche una sequenza di segnale debole per controllare la loro localizzazione iniziale: un NLS debole per LEXY e un NES debole per LINuS. L'attivazione dei sistemi mediante illuminazione a luce blu induce quindi la loro esportazione per LEXY o la loro importazione per LINuS, consentendo agli utenti di monitorare l'esportazione o l'importazione nucleare. Abbreviazioni: LEXY = sistema di esportazione nucleare inducibile dalla luce; LINuS = segnale di localizzazione nucleare inducibile dalla luce; NLS = segnale di localizzazione nucleare; NES = segnale di esportazione nucleare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La localizzazione della fluorescenza mCherry riporta la navetta delle sonde LEXY e LINuS tra nuclei e citosol, e può quindi essere seguita nell'imaging di cellule vive, consentendo agli utenti di monitorare l'NCT. Oltre ad essere utilizzati come semplici sonde, LEXY e LINuS possono anche essere ingegnerizzati per controllare la localizzazione e studiare le proteine di interesse, in vitro 5,6,8,9 o in vivo 10,11.
Il metodo di quantificazione proposto nelle pubblicazioni LEXY e LINuS mostra l'intensità nucleare relativa delle sonde. L'analisi suggerita viene eseguita manualmente e si basa sulla misurazione di una regione di interesse (ROI) nel nucleo e nel citosol. Sebbene questo metodo fornisca una buona rappresentazione del segnale della sonda nel tempo, è molto lungo e noioso, soprattutto quando gli esperimenti e le condizioni vengono ripetuti. È importante sottolineare che questo metodo manca anche di precisione poiché è rappresentata solo una piccola parte del compartimento progettato.
Qui proponiamo un nuovo protocollo per la quantificazione dei segnali fluorescenti LEXY e LINuS. Abbiamo implementato tecniche automatizzate, che facilitano le analisi e garantiscono una maggiore precisione. Ciò faciliterà il processo per i nuovi utenti di questi strumenti e contribuirà ad aumentare la produttività. Il nostro protocollo di quantificazione utilizza una sola interfaccia, il plug-in open-source TrackMate12 di FIJI. In particolare, per migliorare l'affidabilità delle quantificazioni, abbiamo utilizzato un marcatore di DNA rosso lontano compatibile con l'imaging dal vivo per eseguire la segmentazione dell'intero nucleo con StarDist13, una rete neurale convoluzionale addestrata, combinata con il tracciamento e la misurazione del segnale fluorescente della sonda con TrackMate12.
I dati ottenuti possono quindi essere facilmente esportati nel foglio di calcolo fornito e pronto all'uso (Tabella supplementare S1) per ottenere l'intensità nucleare relativa di ciascun nucleo identificato. Questo protocollo spiega anche come raggruppare i valori ottenuti in un grafico adattando la curva dell'andamento temporale ottenuta a un modello monoesponenziale, come in Yoo e Mitchison14 e come calcolare la velocità di trasporto per le diverse condizioni testate. Con questo protocollo e il foglio di calcolo fornito per l'analisi, gli utenti saranno in grado di quantificare facilmente i dati di imaging di cellule vive, anche con competenze bioinformatiche limitate.

<table><tbody><tr><td>Collagene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>LEICA</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Eccellere</td><td>Valentina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Software FIJI</td><td>FIGI</td><td></td><td>ImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>Piatti al fluoro</td><td>Dutscher</td><td>FD3510-100</td><td>Alternativa: Camera Attofluor (Invitrogen #A7816)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.4.1</td><td>Software GraphPad, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Importazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>Leptomicina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide LEXY</td><td>Addgene</td><td>72655</td><td>pDN122</td></tr><tr><td>Plasmide LINuS</td><td>Addgene</td><td>61347</td><td>pDN77</td></tr><tr><td>Matita-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM senza rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td>Spirocromo</td><td>SC007</td><td>Alternativa: SPY-DNA650 (Spirochrome #SC501)</td></tr><tr><td>Plugin 2D Stardist</td><td>Distribe stellare</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>Plugin TrackMate</td><td>TrackMate</td><td></td><td>TrackMate-7.14.0</td></tr></tbody></table>

utilizzo degli strumenti di optogenetica lexy e linus e dell'analisi automatizzata delle immagini per quantificare le dinamiche di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

Il protocollo sopra menzionato dovrebbe consentire agli utenti di visualizzare la localizzazione e la traslocazione della sonda durante l'acquisizione nell'imaging di cellule vive. Un esempio delle immagini attese acquisite per visualizzare l'esportazione nucleare con LEXY è mostrato nella Figura 4. Una rapida diminuzione del segnale dal nucleo e un arricchimento nel citosol dovrebbero essere osservati dopo un paio di cicli di illuminazione a luce blu. Un recupero progressivo del segnale della sonda può essere visibile dopo l'arresto dei cicli di illuminazione. Per controllare il sistema, la leptomicina B, un inibitore delle esportazioni, attesta che un cambiamento nell'esportazione può essere visualizzato con le analisi, poiché impedisce l'esportazione di LEXY in seguito all'illuminazione a luce blu (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg"> 
Figura 4: Visualizzazione del segnale di LEXY nel tempo. Acquisizione di punti temporali rappresentativi delle fasi di stabilità, illuminazione e recupero, acquisiti con imaging di cellule vive. La condizione di metanolo rappresenta la condizione di controllo. Dopo l'illuminazione pulsatile in luce blu, in rosso, il segnale fluorescente mCherry, reporter della posizione di LEXY, viene traslocato dal nucleo al citosol. Dopo aver interrotto l'illuminazione, il segnale viene recuperato nel nucleo. Il trattamento con l'inibitore dell'esportazione leptomicina B a 1 nM o 0,5 nM mostra l'assenza o la diminuzione dell'esportazione di LEXY quando l'esportazione è bloccata. Barra della scala = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per quanto riguarda le analisi, mentre i valori della curva di intensità nucleare relativa durante la fase stabile dovrebbero essere intorno a 1, dopo l'attivazione della luce blu, dovrebbero mostrare una lenta diminuzione fino a raggiungere un plateau alla fine della fase di illuminazione (Figura 5A). Se la diminuzione è troppo veloce o troppo lenta, i parametri di acquisizione possono essere ottimizzati (vedi discussione). Il trattamento con leptomicina B a concentrazioni sufficienti può anche confermare che le analisi e la tecnica sono abbastanza sensibili da dimostrare che l'esportazione nucleare è completamente bloccata, con valori di intensità nucleare relativi stabili a circa 1 per l'intero esperimento. Concentrazioni intermedie di leptomicina B, tuttavia, dovrebbero mostrare una lieve esportazione nucleare (Figura 5A). Queste osservazioni visive dovrebbero essere confermate quantitativamente con l'aumento del tasso di esportazione (Figura 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg"> 
Figura 5: Intensità nucleare relativa attesa di LEXY e velocità di trasporto. (A) Il grafico rappresenta l'intensità nucleare relativa del segnale fluorescente di LEXY nel tempo, normalizzata all'intensità media mCherry della fase stabile. L'intensità nucleare relativa della condizione di metanolo (controllo, rosso) diminuisce della metà dopo l'illuminazione, a differenza delle cellule trattate con l'inibitore dell'esportazione leptomicina B, a una concentrazione di 0,5 nM (blu chiaro) o 1 nM (blu scuro). Barre di errore: SEM. (B) Velocità di esportazione delle condizioni di controllo e di leptomicina B, ottenuta adattando la curva ad un modello monoesponenziale. I valori ottenuti quando l'esportazione è bloccata dalla leptomicina B sono significativamente inferiori alla condizione di controllo. N = 18 cellule per il metanolo (rosso), 19 cellule per la leptomicina B 0,5 nM (azzurro) e 15 cellule per la leptomicina B 1 nM (blu scuro). I valori di P sono stati calcolati mediante un test t di Welch a due lati. : P &lt; 1×10−4, ****: P &lt; 1×10−5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella supplementare S1: foglio di calcolo con calcoli predefiniti. Questo foglio di calcolo viene fornito per facilitare l'analisi. I valori di intensità ottenuti con TrackMate possono essere copiati e incollati direttamente nel foglio di calcolo per ottenere i valori di intensità nucleare relativi normalizzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare S2: Esempio dei risultati attesi per una condizione di controllo dell'analisi di LEXY. Il foglio di calcolo rappresenta un esempio dei valori ottenuti per una condizione di controllo della linea cellulare stabile di LEXY. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Utilizzo degli strumenti di optogenetica LEXY e LINuS e dell'analisi automatizzata delle immagini per quantificare le dinamiche di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive

Nucleocytoplasmic transport (NCT) is essential for maintaining cellular homeostasis, and its disruption is involved in various diseases, including ...

Il nostro laboratorio studia l'interazione tra i pori nucleari e l'organizzazione della cromatina. Quindi studiamo come i pori nucleari influenzano l'organizzazione della cromatina, ma anche inversamente se l'organizzazione della cromatina influenza la funzione dei pori nucleari, specialmente nel trasporto nucleocitoplasmatico. Il trasporto nucleocitoplasmatico è un processo molto veloce, quindi una sfida è rilevare i cambiamenti nella dinamica del trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive.Non ci sono molti strumenti disponibili per monitorare il trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive. Implementando una tecnica semi-automatizzata e migliorata, speriamo di facilitare l'uso di questi strumenti. Il nostro protocollo si basa sul deep learning.Limita l'errore e riduce notevolmente il tempo necessario per l'analisi. Ciò che prima richiedeva un giorno, ora richiede solo un'ora o due. Per iniziare, avvia il software FIJI sul sistema informatico.Selezionare la fase stabile come immagine uno, la fase di illuminazione come immagine due e la fase di recupero come immagine tre. Concatenare le tre immagini che rappresentano tre fasi per produrre un'unica immagine. Salvare l'immagine ottenuta e unita per la segmentazione accedendo a File e selezionando Salva come TIFF.Quindi, dividi il canale mCherry selezionando Immagine, Colore e Dividi canali. Quindi salva l'immagine divisa andando su File, Salva con nome e TIFF. Per verificare la presenza di sbiancamento durante l'acquisizione, selezionare in sequenza Immagine, Pile e Stampa profilo asse Z.Quindi fare clic su Dati, seguito da Copia primo set di dati, e incollarlo nel foglio di calcolo fornito sotto la cella del profilo dell'asse Z. Ora disegna una regione circolare di interesse, approssimando la dimensione media di un nucleo, cliccando su Analizza, seguito da Strumenti e cliccando su ROI Manager. Aggiungi il ROI e salvalo navigando su Altro e facendo clic su Salva.Posiziona il ROI salvato in una regione priva di celle durante il time-lapse. Assicurati che il valore di grigio medio" sia selezionato in Analizza e imposta misurazioni. Quindi fare clic su Altro, Multi Misura.Seleziona Misura tutte le 50 fette" e Un ROI per fetta" e fai clic su OK per registrare l'intensità. Copia e incolla tutti i valori di intensità misurati nel foglio di calcolo fornito sotto la cella di sfondo ROI. Quindi chiudi l'immagine con solo il canale mCherry e seleziona l'immagine salvata con i canali uniti.Ora apri il plug-in TrackMate facendo clic in sequenza su Plugin, Tracking e TrackMate. Verificare che i punti temporali siano compresi tra zero e 49 e fare clic su Avanti. Selezionare il rilevatore StarDist e fare clic su Avanti.Scegli il canale due, SiR-DNA, per la segmentazione dei nuclei e attendi il completamento del processo. Lasciare i parametri predefiniti nella finestra di soglia e fare clic su Avanti. Crea filtri utilizzando l'intensità media, canale uno, per escludere i nuclei con valori di segnale estremi.Creare un filtro per selezionare i valori al di sopra della soglia definita e l'altro per selezionare i valori al di sotto della soglia. Allo stesso modo, aggiungi due filtri di area per rimuovere detriti o cellule morenti e fai clic su Avanti. Scegli il tracker LAP semplice e fai clic su Avanti.Quindi, regola i parametri di tracciamento. Impostare la distanza massima di collegamento" su 30 micrometri, la distanza massima di chiusura dello spazio "su 15 micrometri e la distanza massima di chiusura dello spazio" su tre. Quindi fare clic su Avanti.Dopo i calcoli, fare clic su Avanti per impostare i filtri sulle tracce. Per selezionare solo i nuclei che sono stati tracciati durante l'intero corso di tempo, scegliere il numero più alto di punti nella traccia e fare clic su Avanti. Quindi selezionare Visualizza nomi dei punti"per ripercorrere ogni nucleo in ulteriori analisi e personalizzare altre funzioni di visualizzazione come preferisci.In fondo alla pagina, fai clic su Tracce e scegli Esporta in CSV" per salvare la tabella delle misure. Chiudi la tabella e procedi facendo clic su Avanti. Ora fai clic su Cattura sovrapposizione"come azione, quindi premi su Esegui, seguito da OK per generare un'immagine con nuclei tracciati.Salva l'immagine facendo clic in sequenza su File, Salva con nome e scegliendo TIFF. Per importare il file CSV di TrackMate nel foglio di calcolo fornito, fare clic sulla scheda Dati. Nel gruppo "Ottieni dati di trasformazione", fare clic su Da testo/CSV" e fare clic su Importa.Copia la colonna Spot IDB, Track IDC, Frame I e l'intensità media del canale 1M e incollala nelle colonne da A a D del foglio di calcolo fornito. Ordina i risultati in ordine alfabetico prima per Track ID, singolo nucleo, dalla cella B5 e poi per Frame, punto temporale, dalla cella C5. Ora apri GraphPad Prism, crea un nuovo foglio e copia e incolla la colonna del tempo dal foglio di calcolo. Quindi incolla i valori ottenuti come intensità nucleare relativa nella tabella GraphPad Prism.Per generare il grafico dell'intensità nucleare relativa, accedere alla sezione Grafico e selezionare XY come famiglia di grafi. Quindi scegli Punti e linea di collegamento con barre di errore"come tipo di grafico. Nelle impostazioni del grafico, scegli Media ed Errore" e SEM, quindi fai clic su OK. Successivamente, per ottenere la velocità di esportazione, fare clic su Nuova tabella dati e inserire i tempi in decimali solo per le fasi stabili e di illuminazione.Incollare nella tabella i valori ottenuti come intensità nucleare relativa per queste fasi. Nella sezione Risultati, fare clic su Analisi XY seguita da Esponenziale. Quindi scegli Regressione non lineare e fai clic su OK. Seleziona Plateau seguito da un decadimento di fase" come modello sotto i parametri.Quindi scegli una costante uguale a 2,25 come X0, una costante uguale a uno come Y0 e una costante uguale a zero per il plateau. Indicare che K deve essere maggiore di zero e premere OK. Creare una nuova tabella e trasporre con incolla i valori K ottenuti. Nella sezione Grafico, selezionare Colonna come famiglia di grafi e scegliere il grafico a violino come tipo di grafico.Seleziona Mostra tutti i punti"come grafico e fai clic su OK. L'esportazione nucleare con la sonda optogenetica lexy è stata visualizzata nell'imaging di cellule vive. Nella condizione di controllo con celle trattate con metanolo, l'intensità nucleare di mCherry è diminuita bruscamente dopo l'illuminazione a luce blu, seguita da un graduale recupero durante la fase di post-illuminazione. Il trattamento con l'inibitore dell'esportazione, la leptomicina B, ha causato un cambiamento nell'esportazione nucleare, poiché il segnale della sonda è rimasto costantemente nucleare in tutti i punti temporali.L'analisi quantitativa dell'intensità nucleare relativa ha mostrato nel tempo una lenta diminuzione fino a raggiungere un plateau alla fine della fase di illuminazione. Concentrazioni intermedie di leptomicina B dovrebbero mostrare una lieve esportazione nucleare. I tassi di esportazione calcolati dai dati di intensità hanno confermato un tasso di esportazione significativamente più elevato nelle cellule trattate con metanolo, un tasso molto più basso con 0,5 nanomolari di leptomicina B e quasi nessuna esportazione con un nanomolare di leptomicina B.

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Utilizzo degli strumenti di optogenetica LEXY e LINuS e dellanalisi automatizzata delle immagini per quantificare le dinamiche di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive (Video) | JoVE Journal

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