Utilizzo degli strumenti di optogenetica LEXY e LINuS e dell'analisi automatizzata delle immagini per quantificare le dinamiche di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive

Il nostro laboratorio studia l'interazione tra i pori nucleari e l'organizzazione della cromatina. Quindi studiamo come i pori nucleari influenzano l'organizzazione della cromatina, ma anche inversamente se l'organizzazione della cromatina influenza la funzione dei pori nucleari, specialmente nel trasporto nucleocitoplasmatico. Il trasporto nucleocitoplasmatico è un processo molto veloce, quindi una sfida è rilevare i cambiamenti nella dinamica del trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive.

Non ci sono molti strumenti disponibili per monitorare il trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive. Implementando una tecnica semi-automatizzata e migliorata, speriamo di facilitare l'uso di questi strumenti. Il nostro protocollo si basa sul deep learning.

Limita l'errore e riduce notevolmente il tempo necessario per l'analisi. Ciò che prima richiedeva un giorno, ora richiede solo un'ora o due. Per iniziare, avvia il software FIJI sul sistema informatico.

Selezionare la fase stabile come immagine uno, la fase di illuminazione come immagine due e la fase di recupero come immagine tre. Concatenare le tre immagini che rappresentano tre fasi per produrre un'unica immagine. Salvare l'immagine ottenuta e unita per la segmentazione accedendo a File e selezionando Salva come TIFF.

Quindi, dividi il canale mCherry selezionando Immagine, Colore e Dividi canali. Quindi salva l'immagine divisa andando su File, Salva con nome e TIFF. Per verificare la presenza di sbiancamento durante l'acquisizione, selezionare in sequenza Immagine, Pile e Stampa profilo asse Z.

Quindi fare clic su Dati, seguito da Copia primo set di dati, e incollarlo nel foglio di calcolo fornito sotto la cella del profilo dell'asse Z. Ora disegna una regione circolare di interesse, approssimando la dimensione media di un nucleo, cliccando su Analizza, seguito da Strumenti e cliccando su ROI Manager. Aggiungi il ROI e salvalo navigando su Altro e facendo clic su Salva.

Posiziona il ROI salvato in una regione priva di celle durante il time-lapse. Assicurati che il valore di grigio medio" sia selezionato in Analizza e imposta misurazioni. Quindi fare clic su Altro, Multi Misura.

Seleziona Misura tutte le 50 fette" e Un ROI per fetta" e fai clic su OK per registrare l'intensità. Copia e incolla tutti i valori di intensità misurati nel foglio di calcolo fornito sotto la cella di sfondo ROI. Quindi chiudi l'immagine con solo il canale mCherry e seleziona l'immagine salvata con i canali uniti.

Ora apri il plug-in TrackMate facendo clic in sequenza su Plugin, Tracking e TrackMate. Verificare che i punti temporali siano compresi tra zero e 49 e fare clic su Avanti. Selezionare il rilevatore StarDist e fare clic su Avanti.

Scegli il canale due, SiR-DNA, per la segmentazione dei nuclei e attendi il completamento del processo. Lasciare i parametri predefiniti nella finestra di soglia e fare clic su Avanti. Crea filtri utilizzando l'intensità media, canale uno, per escludere i nuclei con valori di segnale estremi.

Creare un filtro per selezionare i valori al di sopra della soglia definita e l'altro per selezionare i valori al di sotto della soglia. Allo stesso modo, aggiungi due filtri di area per rimuovere detriti o cellule morenti e fai clic su Avanti. Scegli il tracker LAP semplice e fai clic su Avanti.

Quindi, regola i parametri di tracciamento. Impostare la distanza massima di collegamento" su 30 micrometri, la distanza massima di chiusura dello spazio "su 15 micrometri e la distanza massima di chiusura dello spazio" su tre. Quindi fare clic su Avanti.

Dopo i calcoli, fare clic su Avanti per impostare i filtri sulle tracce. Per selezionare solo i nuclei che sono stati tracciati durante l'intero corso di tempo, scegliere il numero più alto di punti nella traccia e fare clic su Avanti. Quindi selezionare Visualizza nomi dei punti"per ripercorrere ogni nucleo in ulteriori analisi e personalizzare altre funzioni di visualizzazione come preferisci.

In fondo alla pagina, fai clic su Tracce e scegli Esporta in CSV" per salvare la tabella delle misure. Chiudi la tabella e procedi facendo clic su Avanti. Ora fai clic su Cattura sovrapposizione"come azione, quindi premi su Esegui, seguito da OK per generare un'immagine con nuclei tracciati.

Salva l'immagine facendo clic in sequenza su File, Salva con nome e scegliendo TIFF. Per importare il file CSV di TrackMate nel foglio di calcolo fornito, fare clic sulla scheda Dati. Nel gruppo "Ottieni dati di trasformazione", fare clic su Da testo/CSV" e fare clic su Importa.

Copia la colonna Spot IDB, Track IDC, Frame I e l'intensità media del canale 1M e incollala nelle colonne da A a D del foglio di calcolo fornito. Ordina i risultati in ordine alfabetico prima per Track ID, singolo nucleo, dalla cella B5 e poi per Frame, punto temporale, dalla cella C5. Ora apri GraphPad Prism, crea un nuovo foglio e copia e incolla la colonna del tempo dal foglio di calcolo. Quindi incolla i valori ottenuti come intensità nucleare relativa nella tabella GraphPad Prism.

Per generare il grafico dell'intensità nucleare relativa, accedere alla sezione Grafico e selezionare XY come famiglia di grafi. Quindi scegli Punti e linea di collegamento con barre di errore"come tipo di grafico. Nelle impostazioni del grafico, scegli Media ed Errore" e SEM, quindi fai clic su OK. Successivamente, per ottenere la velocità di esportazione, fare clic su Nuova tabella dati e inserire i tempi in decimali solo per le fasi stabili e di illuminazione.

Incollare nella tabella i valori ottenuti come intensità nucleare relativa per queste fasi. Nella sezione Risultati, fare clic su Analisi XY seguita da Esponenziale. Quindi scegli Regressione non lineare e fai clic su OK. Seleziona Plateau seguito da un decadimento di fase" come modello sotto i parametri.

Quindi scegli una costante uguale a 2,25 come X0, una costante uguale a uno come Y0 e una costante uguale a zero per il plateau. Indicare che K deve essere maggiore di zero e premere OK. Creare una nuova tabella e trasporre con incolla i valori K ottenuti. Nella sezione Grafico, selezionare Colonna come famiglia di grafi e scegliere il grafico a violino come tipo di grafico.

Seleziona Mostra tutti i punti"come grafico e fai clic su OK. L'esportazione nucleare con la sonda optogenetica lexy è stata visualizzata nell'imaging di cellule vive. Nella condizione di controllo con celle trattate con metanolo, l'intensità nucleare di mCherry è diminuita bruscamente dopo l'illuminazione a luce blu, seguita da un graduale recupero durante la fase di post-illuminazione. Il trattamento con l'inibitore dell'esportazione, la leptomicina B, ha causato un cambiamento nell'esportazione nucleare, poiché il segnale della sonda è rimasto costantemente nucleare in tutti i punti temporali.

L'analisi quantitativa dell'intensità nucleare relativa ha mostrato nel tempo una lenta diminuzione fino a raggiungere un plateau alla fine della fase di illuminazione. Concentrazioni intermedie di leptomicina B dovrebbero mostrare una lieve esportazione nucleare. I tassi di esportazione calcolati dai dati di intensità hanno confermato un tasso di esportazione significativamente più elevato nelle cellule trattate con metanolo, un tasso molto più basso con 0,5 nanomolari di leptomicina B e quasi nessuna esportazione con un nanomolare di leptomicina B.